聚吡咯/聚乳酸生物材料聯合骨髓基質細胞移植治療脊髓損傷的基礎研究

Raynald，舒 兵，黃 華，周俊峰，孫曉丹，秦 川，安沂華2,*

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021； 2.中國人民武裝警察部隊總醫院，北京 100039； 3.首都醫科大學北京三博腦科醫院，北京 100093； 4.清華大學材料學科與工程系，北京 100084； 5.首都醫科大學北京市神經外科研究所，北京 100050)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可能會導致損傷節段以下機體感覺和運動功能喪失，目前尚沒有有效的治療措施。脊髓損傷的治療方法包括手術、藥物和康復等，可以對神經功能的缺失有一定的改善作用，然而這些治療手段并不能從根本上解決脊髓損傷的問題，近年來神經再生研究發展迅速，為SCI帶來了新的希望。隨著組織工程學技術的發展，采用復合生物材料移植治療SCI也得到了很多關注。聚吡咯(polypyrrole，PPy)作為導電生物材料由于其具有較好組織相容性被用于制作生物支架。而骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)在修復中樞神經系統中有著重要的作用[1]，最近的研究發現電刺激可以促進細胞增殖分化從而促進組織再生[2-3]。本研究嘗試利用骨髓基質細胞作為種子細胞，聚吡咯/聚乳酸(Polypyrrole/Poly Lactic Acid，PPy/PLA)材料作為支架，研究干細胞聯合導電材料支架在SCI中的修復作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠27只，雌性，體重200～220 g，10周齡。購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2012-0001]。實驗在北京市神經外科研究所動物實驗設施內進行[SYXK(京)2013-0009]。

1.2 主要試劑及儀器

10%胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(含EDTA)、DMEM/F12、TritonX-100(Invitrogen)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，北京化工廠)；聚吡咯納米顆粒粉末(國藥集團)；二氯甲烷(DCM，北京化工廠)；聚乳酸(山東省醫療器械研究所)；NF抗體(Abcam)；PBS緩沖液(GIBCO)；NeuN抗體(Abcam)；熒光標記二抗TRITC(Jackson ImmunoResearch)；RT試劑盒(Invitrogen)；RNA提取試劑盒(Promega)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystem 7500 Fast)；微量紫外分光光度計(NanoDrop 2000 C)；手術顯微鏡(上海精密儀器廠，SXP-1C)；倒置相差熒光顯微鏡(ZEISS，Axio Observer A1)；超聲波細胞破碎儀超聲(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

選取200 g成年大鼠，摘除雙側股骨。經過抗凝處理的大鼠骨髓5 mL，將用密度梯度離心法分離骨髓基質細胞，室溫1500 r/min，離心10 min，棄上清，沉淀物用PBS洗滌再離心2次后，將細胞重懸(密度為4×107/mL)于DMEM+10%胎牛血清的完全培養基中，置培養箱培養(37℃、5% CO2)；每3～4 d進行換液；細胞生長至80%融合，用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，繼續傳代培養。

1.3.2 聚吡咯/聚乳酸材料的制備

將聚吡咯納米顆粒粉末分散于N,N-二甲基甲酰胺中得到質量體積濃度為5.6%的聚吡咯懸浮液。使用超聲波細胞破碎儀超聲至聚吡咯顆粒均勻分散，然后攪拌過夜。聚乳酸以質量體積濃度為 18.75%的濃度溶于二氯甲烷。將聚吡咯懸浮液滴加到聚乳酸溶液中，直至 DMF∶DCM=1∶2。繼續攪拌24 h得到混合均勻的聚吡咯/聚乳酸靜電紡絲前驅液。向聚乳酸溶液中加入DMF溶液直至 DMF∶DCM=1∶2，則可以得到聚乳酸靜電紡絲前驅液。

1.3.3 動物分組

SD大鼠27只，隨機分為3組，每組9只，分別為單純損傷組(對照組)、PPy/PLA移植組、PPy/PLA/BMSCs移植組。

1.3.4 制作脊髓全橫斷模型

大鼠腹腔注射水合氯醛(0.4 mL/100 g)麻醉后，常規無菌操作，暴露T 7～9節段脊髓，在T8水平脊髓頭尾端完全橫斷脊髓，用虹膜剪刀去除長度約2.5 mm脊髓組織，確保損傷脊髓頭尾端完全離斷。將PPy/PLA復合導電材料和培養的BMSCs移植到脊髓損傷區域后，進行逐層縫合；對于單純PPy/PLA組大鼠不移植BMSCs；對單純損傷組大鼠不移植PPy/PLA復合導電材料和BMSCs，其后依次逐層縫合。

1.3.5 免疫熒光染色

脊髓全橫斷6周后，采用心臟灌注固定(固定液：4%中性多聚甲醛)，以損傷中心為中點，取出長度約2 cm的脊髓組織，4%中性多聚甲醛固定2 h，其后冰凍切片(片厚15 μm)，進行免疫熒光染色。所使用的一抗分別為：NF(1∶200)、NeuN(1∶200)。具體的染色方法：0.01 mol/L PBS浸泡20 min；TritonX-100室溫30 min，0.01 mol/L PBS 洗3次，每次5 min；滴加正常羊血清封閉液封閉非特異性反應，37℃ 30 min后棄去封閉液，直接加一抗(NF、NeuN)40℃過夜；取加一抗的脊髓標本，放置室溫10 min；PBS洗3次后免疫熒光染色加1∶100 TRITC熒光標記二抗，室溫避光5 h，PBS洗3次，每次5 min，用熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 損傷部位形態學評價

大鼠存活6周后處死，分別采用共聚焦顯微鏡和電鏡，觀察3組大鼠，明確脊髓損傷局部新生軸突是否存在，記錄形態是否存在差別。

注：A：對照組(全橫斷)；B：PPy/PLA納米纖維支架組；C：PPy/PLA納米纖維支聯合BMSCs組。圖1 各組損傷后6周NF免疫熒光染色陽性表達Note. A: Control group(Complete transection).B: PPy/PLA nanofibrous scaffold group.C: PPy/PLA nanofibrous scaffold combined with BMSCs group.Figure.1 NF immunofluorescence staining 6 weeks after operation in each group

1.3.7 實時熒光定量PCR(RT-PCR)

檢測脊髓中的血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、Caspase3，Casp3轉錄情況，抽提各組細胞總RNA，微量紫外分光光度計測定RNA，確定A260與A280比值在1.8～2.0。qPCR逆轉錄法合成cDNA，應用RT試劑盒根據primerbank進行引物合成，設計VEGFA、Casp3及內參基因GAPDH引物。VEGFA上游引物：5’-CCAGGCTGCACCCACGACAG-3’，下游引物：5’- TCATTGCAGCAGCCCGCAC-3’，擴增長度192 bp；Casp3上游引物：5’-ACTGGAAAGCCGAAACTCTT CATCA-3’，下游引物：5’-GGAAGTCGGCCTCCAC TGGTATC-3’，擴增長度127 bp；GAPDH上游引物：5’-TGGAGTCTACTGGCGTCTT-3’，下游引物：5’- TGTCATATTTCTCGTGGTTCA-3’，擴增長度138 bp。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 免疫熒光與定量PCR評價局部形態

在脊髓損傷區域6周后，可見NF陽性表達的細胞(圖1)。大鼠移植PPy/PLA/BMSCs組(521.4+58.97)顯示NF陽性明顯多于PPy/PLA(475.6+35.01)與對照組(404.9+31.12)。在損傷區域，可見NeuN陽性的細胞(圖2A～C)。大鼠移植PPy/PLA/BMSCs組(35.81+6.01)顯示NeuN陽性明顯多于PPy/PLA(30.11+4.61)與對照組(19.42+3.8)(圖3)。

2.2 VEGFA、Casp3基因表達

脊髓損傷區域內，PPy/PLA組和PPy/PLA/BMSCs組中的轉錄VEGFA mRNA量和轉錄Casp3 mRNA量在術后6周明顯高于對照組。(圖4)

2.3 電鏡評價損傷局部形態

采用半薄切片投射電鏡，觀察術后6周損傷區域的脊髓組織，單純脊髓損傷組可見大量的成纖維細胞(白色箭頭)，有較多膠原成分分布于成纖維細胞之間，可見較多膠原瘢痕，膠原瘢痕組織為成纖維細胞與膠原共同形成，新生髓鞘少見(黑色箭頭)，生長欠佳。在PPy/PLA與PPy/PLA/BMSCs移植組，移植區域可見到新生有髓神經纖維(圖5)。損傷后6周，PPy/PLA/BMSCs移植組(12.96+1.74)的軸突數量大于PPy/PLA(8.19+1.62)與對照組(4.59+1.19)，差異有顯著性(P< 0.01)。(見圖6)

注：A：對照組(全橫斷)；B：PPy/PLA納米纖維支架組；C：PPy/PLA納米纖維支聯合BMSCs組。圖2 各組損傷后6周NeuN免疫熒光染色陽性表達Note.A: Control group(Complete transection).B: PPy/PLA nanofibrous scaffold group.C: PPy/PLA nanofibrous scaffold combined with BMSCs group.Figure.2 NeuN immunofluorescence staining 6 weeks after operation in each group

注：與對照組比較，*P< 0.05；與PPy/PLA組比較，#P< 0.05。下同。圖3 損傷后6周各組的NF與NeuN免疫熒光表達定量Note.Compared with the control group,*P< 0.05.Compared with the PPy/PLA group,#P< 0.05.The same below.Figure.3 Quantification of NF and NeuN immunofluorescence expression 6 weeks after operation in each group

圖4 各組術后VEGFA，Casp3表達Figure.4 Expression of VEGFA and Casp3 6 weeks after operation in each group

注：A：對照組(全橫斷)；B：PPy/PLA納米纖維支架組；C：PPy/PLA納米纖維支聯合BMSCs組；軸突(黑色箭頭)；成纖維細胞(白色箭頭)。圖5 TEM新軸突生長在各組損傷后6周Note.A: Control group(Complete transection); B:PPy/PLA nanofibrous scaffold group; C:PPy/PLA nanofibrous scaffold combined with BMSCs group.Axon (black arrow). Fiber cells (white arrow).Figure.5 TEM image of new axon formation in each group 6 weeks after operation

圖6 損傷后6周各組的軸突定量Figure.6 Quantification of axon quantity 6 weeks after operation in each group

3 討論

有研究表明，脊髓損傷后給與電刺激能促進損傷部位的神經修復，而導電高分子材料可以為這種神經修復方式提供電傳導的介質，而且可以在電刺激的同時結合其他誘導因素促進神經修復[4]。目前應用于組織工程的很多聚合物不具備或具有較低的傳導電信號的能力，因而其對神經功能的恢復能力有限。具有導電性的材料能提高材料與種子細胞以及神經組織的相容性，增強材料對種子細胞以及神經組織的支持作用。PPy具有良好的細胞相容性和電傳導性能，但是單純的PPy易碎且不能降解，而PLA是可降解性聚合物。作為細胞移植的載體已被體外實驗證實，PC12細胞、施萬細胞和嗅鞘細胞均可在PPy表面良好地存活和生長[5-8]。因此本研究合成PPy與PLA支架材料。PPy/PLA復合支架促進神經再生，且由于其本身可生物降解的特性，無需有創干預取出移植物。本研究團體近期的研究也證實施萬細胞和人臍帶間充質干細胞在PPy/PLA支架上能夠很好地生長和存活[2-3]。這些研究與前期關于PPy材料良好組織相容性的研究相一致[9-10]。BMSCs具有多向分化、自我更新和分泌營養因子的潛能。許多研究已證明，BMSCs治療中樞神經系統損傷具有巨大潛力，能通過促進自我修復和新血管生成等多種途徑來修復中樞神經系統損傷。因此，本實驗聯合使用PPy/PLA支架材料與BMSCs治療大鼠脊髓損傷并探討其治療的可能機制。

脊髓損傷導致感覺和運動功能喪失。這由于損傷導致的原發性神經元的損害，以及損傷后的復雜病理生理改變影響了局部微環境產生了繼發性損害，從而阻礙軸突再生和延伸。脊髓損傷后自發的軸突再生能力有限。國內外諸多研究表明，引導再生的軸突穿過損傷間隙與遠端是治療脊髓損傷的主要策略[11-12]。PPy/ PLA可降解生物材料促進周圍神經再生的研究前期已有相關報道，Xu等[4]使用PPy/PDLLA修復大鼠坐骨神經，為以后的神經工程研究帶來希望。然而該材料在中樞神經系統中的研究尚鮮有報道。本研究免疫熒光檢測結果顯示損傷大鼠在接受PPy/PLA及PPy/PLA/BMSCs移植后較對照組顯示出更多的NF陽性信號。而電鏡結果顯示PPy/PLA及PPy/PLA/BMSCs移植后較對照組軸突數量更多。qPCR結果顯示PPy/PLA/BMSCs組較PPy/PLA及對照組的Nefh 和Tubulin表達增加。這些數據表明組織工程支架本身能夠促進再生，而結合BMSCs移植治療也能夠支持和優化損傷部位的再生。

損傷局部的改變，例如水腫、炎癥反應、細胞死亡、脊髓脫髓鞘、血管破壞等，會影響功能恢復。如何改善這些變化對于功能恢復有巨大支持作用。血管再生是神經再生的重要因素。前期研究揭示血管再生可能與神經突再生、軸突再生和神經保護相關[12-15]。而Mihardha等[16]報道了PPy材料的血管生成作用。本研究qPCR檢測顯示PPy/PLA和 PPy/PLA/BMSC治療組較對照組具有更高的VEGF表達。此外，免疫熒光檢測顯示PPy/PLA 和 PPy/PLA/BMSC組NeuN陽性表達較對照組多。qPCR檢測顯示Casp3在PPy/PLA 和 PPy/PLA/BMSC組低表達。這些數據顯示血管生成和神經保護在促進神經生長中發揮重要作用。

綜上所述，應用PPy/PLA/BMSCs在治療中樞神經系統損傷方面具有很大的潛能，有望成為神經修復新的治療策略。其機制可能是PPy/PLA/BMSCs促進血管生成改善微環境并同時給予局部損傷區域神經保護。