三種小鼠腸道病毒核酸檢測技術在小鼠健康監測中的應用

李欣悅，佟 巍，叢日旭，郭 智，蔡 鵑，阮研碩，向志光

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021)

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)，呼腸孤病毒III型(reovirus 3，Reo-3)和小鼠諾如病毒(murine norovirus，MNV)是在實驗小鼠中感染率較高的三個病原體，其中MHV和Reo-3是國內外實驗動物微生物質量要求的必須排除的病原體，MNV雖未列在我國檢測標準項目內，但已在國內多次檢出[1-6]。目前我國實驗動物病毒檢測標準主要是采用血清學方法檢測動物血清中的抗體，屬于回顧性診斷，適用于病毒感染后的檢測。PCR核酸檢測技術是對待檢樣本中病原體的直接檢測，其檢測結果代表當期實驗動物攜帶病原體情況。而且PCR核酸檢測技術具有高度的特異性和敏感性，可在實驗動物感染病原體初期檢測到病原體[7-9]。MHV，Reo-3和MNV屬于腸道病毒，經糞便傳播，可通過對實驗動物盲腸內容物或糞便進行核酸檢測。因此病原微生物核酸檢測在實驗動物健康監測中是非常重要的一部分。本研究對送檢本室的實驗小鼠的盲腸內容物樣品檢測上述三種病毒，并與血清學檢測結果進行了關聯分析，分析核酸檢測在實驗動物健康監測中的適用性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒(Takara，9766)；相關病毒抗體檢測抗原片由本室制備；熒光標記的羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories，115-095-003)；引物和探針由Invitrogen公司合成；一步法逆轉錄核酸擴增試劑盒One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit (Perfect Real Time)(Takara，RR064 A)。

臺式離心機(Thermo fisher, Thermo Scientific Heraeus Fresco 21)；熒光顯微鏡(Nikon，ECLIPSE Ni)；實時PCR系統擴增儀(ABI，7500 Fast)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的選擇和儲存

送檢本室小鼠隨機采樣，無菌采集盲腸內容物樣品272份。每份樣品取0.1 g小鼠盲腸內容物，儲存于-80℃冰箱。

1.2.2 樣品核酸的提取

小鼠盲腸內容物樣品恢復至室溫，加入200 μL PBS溶液渦旋振蕩1 min，經12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液用病毒核酸DNA/RNA提取試劑盒進行核酸提取。

1.2.3 血清學檢測方法和核酸檢測方法結果判定

本實驗室血清學檢測采用間接免疫熒光試驗技術檢測MHV，Reo-3和MNV抗體[10-12]，以1:10稀釋小鼠血清樣品滴加于抗原片，溫育結合，以熒光標記的羊抗小鼠IgG結合抗原抗體復合物，使用熒光顯微鏡觀察記錄抗原孔熒光信號進行血清學判定。小鼠盲腸內容物樣品核酸用探針法實時熒光定量 PCR檢測MHV，Reo-3和MNV核酸[13]，取樣品核酸提取物5 μL，進行一步法逆轉錄實時定量PCR，用實時PCR系統擴增儀對各樣品核酸進行熒光信號檢測。以1×101～1×107copies/μL質粒的CT值繪制標準曲線，作為樣品檢出量估算的基礎。在同一批次檢測試驗同時設置空白對照和陽性對照。陽性對照為含有目標核酸序列10 copies/μL的質粒。陽性對照品的多通道熒光信號圖中顯示熒光標記FAM信號值呈指數上升，擴增曲線圖中熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數(cycle threshold, CT)值小于36；空白對照以水為模板。空白對照的多通道熒光信號圖中顯示熒光標記FAM信號一直為水平線，擴增曲線圖中熒光信號在設定的最高循環數40以內沒有特征性擴增曲線，表明該批檢測試驗體系無污染。滿足上述條件下，待檢樣品的多通道熒光信號圖中顯示熒光標記FAM信號有增長，在擴增曲線圖中有指數增長且曲線光滑，CT值小于40，即判定待檢樣本含有目標病原體核酸。

1.3 統計學方法

對檢測結果進行統計分析，以檢出率表示。對核酸檢出樣品CT值和檢出量分布用GraphPad Prism 7作箱式圖分析。對血清學技術與核酸檢測技術檢測結果的分析使用SPSS 25軟件進行t檢驗獨立樣本分析，以P< 0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 MHV、Reo-3、MNV三種腸道病毒在小鼠盲腸內容物的病毒核酸檢出率和核酸檢出量

圖1 MHV、Reo-3、MNV在小鼠盲腸內容物中的病毒核酸檢測Figure.1 The nucleic acid detection of MHV, Reo-3, and MNV in mouse cecal contents

在272份實驗小鼠盲腸內容物樣品中，MHV、Reo-3、MNV三種腸道病毒核酸檢出率為17.3%，18.8%，16.9%，如圖1A所示。MHV核酸檢出樣品的CT值分布在34～40之間，最大值是39.65，最小值是34.23，中位數是37.71，離群樣品CT值為33.27，31.22和26.3； Reo-3核酸檢出樣品的CT值分布在34～39之間，最大值是39.01，最小值是34.61，中位數是36.96，無離群樣品； MNV核酸檢出樣品的CT值在20～31之間，最大值是30.95，最小值是20.02，中位數是24.84，離群樣品CT值為33.91，33.48，如圖1B所示。根據三種病毒熒光定量PCR方法對1×101copies/μL～1×107copies/μL含有病毒靶序列標準質粒測定而繪制的定量標準曲線公式(MHV：CT=-3.075×X(拷貝數的指數)+38.685；Reo-3：CT=-3.185×X(拷貝數的指數)+40.16；MNV：CT=-3.347×X(拷貝數的指數)+38.618)對盲腸內容物樣品的核酸檢出量進行估算，MHV檢出樣品的核酸檢出量多分布在0～100 copies/μL范圍內，另有3份樣品在102～104copies/μL之間，Reo-3檢出樣品的核酸檢出量多分布在1～100 copies/μL范圍內；MNV檢出樣品的核酸檢出量多分布在100～105copies/μL范圍，另有2份樣品在10～100 copies/μL之間，如圖1C所示。綜上，MHV和Reo-3在小鼠盲腸內容物中的病毒核酸檢出量較低，在1～100 copies/μL之間，而MNV病毒核酸檢出量較高，在100～105copies/μL之間。

2.2 MHV、Reo-3、MNV三種病毒核酸檢測結果與血清學結果關聯分析

本研究抽取的小鼠盲腸內容物樣品有254份存在可比較的MHV、Reo-3血清抗體檢測結果，有243份存在MNV血清抗體檢測結果。其核酸檢測結果與血清學結果匯總見表1。MHV核酸檢出率是16.5%(42/254)，抗體陽性率是1.2%(3/254)，核酸檢出陽性樣品對應的血清學結果均為抗體陰性，抗體陽性結果對應的核酸檢測結果為陰性；Reo-3的核酸檢出率是18.1%(46/254)，抗體陽性率是1.2%(3/254)，核酸檢出陽性樣品對應的血清學結果均為抗體陰性，抗體陽性結果對應的核酸檢測結果為陰性；MNV的核酸檢出率為15.6%(38/243)，抗體陽性率是14.8%(36/243)。在36份血清學抗體陽性的對應盲腸內容物樣品中，對應有24份MNV核酸檢出；在207份血清學抗體陰性的對應盲腸內容物樣品中，對應有14份MNV核酸檢出。對上述2組樣品的MNV檢出的CT值做統計分析(CT值分布見圖2)，在24份MNV抗體陽性組的MNV檢出的CT值與14份在MNV抗體陰性組的MNV檢出的CT值差異無顯著性(P=0.177，P> 0.05)。由此得出，針對免疫應答所產生抗體的血清學檢測結果與針對病毒核酸的小鼠盲腸內容物樣品核酸檢測結果不完全一致，不存在相互替代的關系。

3 討論

3.1 小鼠盲腸內容物病毒核酸低拷貝檢出的情況

小鼠盲腸內容物樣品核酸檢測結果顯示，MHV、Reo-3檢出樣品的CT值大部分在34～40范圍內，部分MNV檢出樣品的CT值在31～33之間，接近或低于陽性對照的CT值。(MHV陽性對照品的CT值均值為35.18，Reo-3陽性對照品的CT值均值為35.62，MNV陽性對照品的CT值均值為33.7。)三種病毒目標擴增序列分別108 bp，67 bp，96 bp，其引物和探針的序列已經覆蓋目標序列的60%以上，具備高度特異性。且空白對照品在40個檢測循環內無特異擴增曲線，可保證檢測反應體系無污染，當檢測樣品在40個檢測循環內出現了特異性擴增曲線，則判為病毒核酸陽性，此種判定方法具有較高的準確性。

表1 MHV、Reo-3、MNV的小鼠盲腸內容物核酸檢測及血清學檢測Table.1 Nucleic acid detection in cecal contents and serological tests of MHV, Reo-3, and MNV

注：“PCR”代表核酸檢測結果；“Ab”代表血清檢測結果；“+”代表陽性；“-”代表陰性。

Note.“PCR” means the results of nucleic acid detection in mice cecal contents.“Ab” means the results of serological test.“+” means positive.“-” means negative.

圖2 MNV抗體陽性和抗體陰性對應的核酸檢出樣品CT值的分布Figure.2 Distribution of CT values of samples with detected nucleic acid corresponding to antibodies positive and negative for MNV

在本次小鼠盲腸內容物樣品核酸檢測中，根據定量標準曲線估算，MHV、Reo-3核酸檢出量范圍在1～100 copies/μL之間，MNV病毒核酸檢出量范圍在100～105copies/μL范圍內。在抗體陰性對應的小鼠盲腸內容物樣品中也有核酸檢出(MHV 42/251，Reo-3 46/251，MNV 14/237)，表明在實驗動物群體中可能存在MHV，Reo-3，MNV的潛伏感染。

3.2 在實驗動物健康監控中核酸檢測與血清學方法互為補充

本研究結果顯示，MHV血清學檢出率較低(3/254)，而血清學檢測陽性的3份樣品核酸檢測卻為陰性；但是在血清學陰性的251份樣品中核酸檢測陽性率為42/251。Reo-3的檢測結果類似。MNV兩種檢測方法似乎有一些相關性：在血清學陽性的36份樣品中，核酸檢測陽性的占比為2/3(24/36)；血清學陰性的207份樣品中，核酸檢測陰性的占比193/207。但是這種相關性較低，同時對檢出樣品分析血清學陽性與陰性之間核酸檢出量，也無統計學差異，在此次樣品調查中，存在血清學結果為陰性對應的盲腸內容物樣品有核酸檢出陽性的情況，這說明血清學不能完全反映實驗動物當期病原體攜帶情況。核酸檢測結果與血清學抗體檢測結果不完全相關，分析這種檢測結果的差異，一方面，這與病原感染時實驗動物體內病毒載量和血清抗體滴度的消長規律相關，如圖3所示：在病原體感染早期，病毒存在指數級的擴增，但動物機體的特異性體液免疫應答在感染最初階段未能快速激活，因此，針對病原免疫抗體的血清學檢測方法存在一定的窗口期(A階段)；理論上存在一個期限，此階段體液免疫已被激活，而且病毒的復制在動物機體內仍然存在，這時無論血清學還是核酸檢測方法都應能檢出(B階段)；在之后，病毒的復制被控制，而免疫抗體將會維持較長的一段時間(C階段)。這種一般規律性的變化是血清學檢測方法與針對病原的核酸檢測出現差異的一種可能原因。另一方面，核酸檢測方法與血清學方法存在各自的敏感性和特異性。一般來說核酸檢測方法因為具有指數放大的效應而十分敏感，高敏感性同時也帶來了特異性的降低，部分樣品的檢測可能受多種因素影響而出現假陽性；因而在進行核酸檢測時需要對多個檢測環節進行質量控制。鑒于此，今后須對兩類方法的適用性進行標準化的病原感染研究，從而實現對檢測結果的確切理解。

注：A階段表示動物攜帶病原體，但不激發免疫應答，或者動物存在感染但抗體產量未達檢測限，使得抗體檢測結果為陰性，核酸檢出陽性；B階段表示動物感染了病原體同時處于排毒階段，能夠同時檢測出抗體陽性和核酸陽性；C階段表示動物感染過病原體，排出病毒量低于核酸方法檢測限時，抗體檢出陽性，核酸檢測結果為陰性。圖3 實驗動物感染病原體期間病毒載量和抗體滴度變化示意圖Note.Phase A indicates that animals carry pathogens but do not elicit an immune response, or animals have an infection but the amount antibody production does not reach the detection limit. It results in antibody negative and nucleic acid positive; phase B indicates that the animal is infected with the pathogen and is detoxifying, so antibody positive and nucleic acid positive were detected. In the C phase, animals were infected with the pathogen, and then the virus output was lower than the detection limit of the nucleic acid method. This result showed antibody positive and the nucleic acid negative.Figure.3 Schematic diagram of viral load and antibody titer changes in laboratory animals infected with virus

對于實驗動物微生物質量的監測，一方面需要了解動物的既往感染史，需要使用血清學方法；而對于病原攜帶狀態，以及環境中病原的豐度的檢測可使用核酸檢測方法。因此在實驗動物健康監測中，病原體核酸檢測結果與血清學結果互為補充，對實驗動物病原潛伏感染或感染過情況予以檢測。