雪貂微衛星DNA遺傳多樣性分析

劉先菊，滕永康，叢日旭，陳 敏，張 旭，向志光，滕慶峰，劉云波*

(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100021； 2.北京華阜康生物科技股份有限公司，北京 102200)

雪貂作為感染性實驗動物模型，其需求和生產規模正不斷擴大、繁殖群體已發展為目前的封閉群動物。封閉群動物因具有雜合特性，從而避免了近交衰退的現象，相對近交系動物具有繁殖率高、疾病抵抗力強的優勢，封閉群動物的關鍵是要保持種群一定的雜合度，并通過遺傳監測實施對其遺傳質量的控制。

封閉群動物的遺傳監測不同于近交系動物，由于個體間具有基因多樣性，遺傳背景靠基因頻率和基因型頻率來體現，需要檢測較多的個體和基因位點。近年，國內多采用的表型如生化標記基因檢測方法主要適用于近交系動物的遺傳檢測，很難反映遺傳多樣性的封閉群動物的遺傳概貌。而微衛星標記不僅具有高度多態性的特點，還廣泛分布于哺乳動物基因組，可提供足夠的檢測位點[1]。因此微衛星標記更適合于封閉群動物的遺傳監測。微衛星DNA標記技術主要采用ROX、FAM及HEX熒光染料標記微衛星引物，可以將多種不同熒光標記、擴增片段的PCR產物在同一電泳加樣孔進行電泳，通過掃描儀和GENESCAN軟件進行圖像收集和分析，可精確計算出微衛星等位基因片段大小，從而提高了微衛星檢測的效率和精確性，使得微衛星DNA檢測技術成為高通量、高效率的基因分型技術，以適應封閉群動物較多檢測位點、較多樣本遺傳檢測的需求。

目前雪貂尚為“實驗用動物”，還沒有國家、行業或地方標準的推出。隨著雪貂的應用及需求量的不斷增長，以及雪貂生產規模的不斷擴大，雪貂的“實驗動物化”管理工作正日益展開，而健康可用于科學研究的實驗動物，除了要求對其攜帶的病原微生物、寄生蟲實施質量控制和監測外，還要求實驗動物具有清晰和明確的遺傳背景。為評估雪貂的遺傳多樣性，盡快建立雪貂地方遺傳質量控制標準和檢測方法，本文通過查閱文獻，篩選、優化了21對雪雕微衛星引物，初步應用微衛星DNA分子標記對雪貂種群的遺傳結構進行了初步分析，為雪貂科學合理的生產繁育及遺傳質量控制將起到指導性意義。

1 材料和方法

1.1 樣本基因組DNA提取

隨機抽取雪貂30只，雌雄各半，4～5月齡，雌性體重700～800 g，雄性體重1000 g。由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所北方資源中心提供。靜脈采血、EDTA抗凝，每只雪貂采血量約0.5 mL。用Easy Pure Blood Genomic DNA kit純化基因組DNA，操作步驟及提取方法詳見試劑盒說明書(code #EE121-01，全式金)。

1.2 主要試劑和儀器

Easy Pure Blood Genomic DNAKit(code #EE121-01，全式金)； 2XEasyTaq PCR Super Mix(AS111-02，全式金)；100 bp DNA Ladder(code 3422 A，TaKaRa)；Gelstain(10000X，貨號GS101)。毛細管電泳檢測和遺傳分析儀3730xl DNA analyzer(ABI)；PCR儀(BIO-RAD，MycyclerTMThermal Cycler 型，USA)；電泳儀(BIO-RAD，210/2.0 Power Supply型，USA)；凝膠成像系統(Tanon-1600型，中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物篩選及PCR擴增

通過查閱文獻，篩選、優化雪貂微衛星引物共21對，經NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists)驗證，這些標記基本覆蓋了雪貂染色體上的遺傳基因概貌，微衛星引物信息詳見表1。 PCR擴增總體系21 μL，其中2XEasyTaq PCR Super Mix 9 μL，模板DNA量1 μL，上、下游引物各0.2 μL(50 μmol/L),DDH2O 9.6 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度55℃～60℃ 30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；72℃繼續延伸8 min，擴增產物4℃保存。

1.3.2 PCR產物鑒定及電泳結果

用2%瓊脂糖凝膠(2%Agrose)電泳，點樣量每孔5 μL，以150 V恒壓30 min進行PCR產物鑒定(見圖1)；再用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，以60 V恒壓2.5 h進行等位基因的分離，上樣量6 μL，用Gelstain緩沖液進行染色(0.1 mol/L NaCl，3XGelstain)，Tanon-1600凝膠成像系統進行成像。

1.3.3 STR掃描

STR一次可掃描3個微衛星位點，每3個位點的反向引物分別用ROX、FAM、HEX三種熒光標記物進行標記，標記后的引物再進行PCR擴增，其擴增產物按1∶3∶5的體積比混合后取1 μL進行毛細管電泳檢測和遺傳分析儀3730xl DNA analyzer(ABI)掃描分析，通過Genemarker V2.2.0(SoftGenetics LLC，State College PA 16803)軟件統計等位基因片段大小，并對掃描峰圖進行數據分析。

1.3.4 數據分析

群體內遺傳結構分析常采用雜合度和多態信息含量進行分析和評估，即將所有樣本的微衛星基因型輸入Popgene1.32軟件，計算不同個體在各個微衛星位點上的觀察等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、表觀雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香隆信息指數(I)及反映Hardy-Weinberg平衡(HW)的P-val；再用PIC-CALC軟件(version-0.6)對每個位點進行多態信息含量(PIC)計算。

2 結果

2.1 PCR擴增產物電泳結果

如圖1所示，經PCR優化，擴增產物豐度較高、特異性較好，初步可以觀察到不同微衛星標記擴增片段大小的差異，即不同引物等位基因的大小差異；進一步用6%非變形的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，可觀察到21個標記多態性信息含量和等位基因片段大小(見圖2)。

2.2 STR掃描結果

篩選的21個雪貂微衛星標記通過PCR擴增，凝膠電泳鑒定豐度較高，用非變性聚丙烯凝膠電泳進行分離，顯示出各位點不同片段大小的等位基因；進一步STR掃描后，30個樣本在21個微衛星標記均檢測到掃描波峰，不同樣本在各位點標明有效等位基因大小及數量(見圖3)。STR掃描可以精確到等位基因片段大小1 bp的差異，圖3中A～D是樣本30、28、27、13在微衛星位點MpuA129w7、MpuB6w2和MpuC102w3的掃描圖；E是樣本10在位點MpuA10w4、MpuA231w6和MpuB12w3的掃描圖；F是樣本30在位點MpuA229w4、MpuB9w7和MpuB12w3的掃描圖。圖3 A、3B只檢測到1個有效等位基因波峰，表示樣本為純合子；圖3C、3D、3E、3F檢測有效等位基因≥2，表明所測樣本均為雜合子。

2.3 多態性分析

30只雪貂在21個微衛星位點共檢測49個觀察等位基因，各位點的等位基因數位于1～4之間，各位點的基因數見表2。其中MpuA223w3、MpuB12w3、MpuB112w5、MpuC102w3均有3個等位基因，MpuB217w3位點有4個等位基因，表現出較高的多態性，21個標記的平均觀察等位基因數為2.3個，有效等位基因數在1～3.750之間，平均有效等位基因數1.669個。

2.4 雜合度和多態信息含量

表2所示，觀察雜合度最大為0.7333，平均為0.3206；期望雜合度在0～0.6424之間，平均期望雜合度為0.3394；平均Shannon信息指數為1.0768，平均多態信息含量(PIC)為0.5485。

注：(M)DL500 bp Ladder。圖1 21個微衛星標記PCR擴增的瓊脂糖電泳Note.(M)DL500 bp Ladder.Figure.1 2% agarose electrophoresis for PCR amplification of 21 microsatellite markers

注：(M)DL500 bp Ladder。圖2 21個微衛星標記PCR擴增的聚丙烯酰胺凝膠電泳Note.(M)DL500 bp Ladder.Figure.2 6% PAGE electrophoresis for PCR amplification of 21 microsatellite markers

注：(A～B)1個有效等位基因；(C～D)2個有效等位基因；(E～F)3個有效等位基因。圖3 雪貂微衛星掃描圖Note.(A-B)1 efficient allelic number(Ne).(C-D)2 efficient allelic number.(E-F)3 efficient allelic number.Figure.3 Scanning maps for ferret microsatellite markers

2.5 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

用Popgene1.32軟件計算實驗用雪貂21個微衛星位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值，結果有5個位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，16個位點群體處于Hardy-Weinberg平衡。(見表2)。

3 討論

微衛星標記存在于大多數原核及真核生物基因組DNA序列，由2～6個核苷酸串聯重復序列構成。物種間和物種個體間的差異及核心序列重復數量的不同，便產生微衛星DNA標記及微衛星DNA的多態性。由于微衛星DNA相對其它分子標記分布廣、信息含量高、多態性豐富、特異性好、操作簡單、且符合孟德爾的共顯性遺傳定律，已廣泛用于實驗動物質量監測及動物群體遺傳結構分析。確切講，微衛星多樣性一般是指群體內個體在DNA水平上的差異，遺傳多樣性分析是評估和了解動物群體的遺傳結構及生活背景，分析其進化的歷史和潛力，并探討種群瀕危的原因和現狀，提出合理的保種措施。為此，應用微衛星標記，檢測個體基因型，統計群體中微衛星位點的等位基因數目和頻率，結合分子遺傳學和數量分類學原理，計算種群的遺傳變異程度、生存穩定性，以評估種群的遺傳多樣性的分化程度[1]。

本文采用的雪貂微衛星引物，是Holly B. Ernest等從雪貂基因組檢索的126對微衛星序列中，通過對澳大利亞雪貂和美國雪貂、野生雪貂、以及野生貂與人工養殖雪貂的雜交群基因組DNA有效的PCR擴增，篩選、優化且具有多態性較好的微衛星序列[2-4]。

群體遺傳多樣性通常用多個基因標記遺傳多樣性的參數平均值來描述，其主要指標有群體平均等位基因數、平均有效等位基因數、平均觀察雜合度、平均期望雜合度、平均多態信息含量等。同時對于群體遺傳多樣性的評價，還要遵循Barker(1994)提出的種群微衛星各個標記上應含有多個等位基因的總體代表性和遺傳標記對基因組的代表性原則[5-9]。基于本原則，我們采用21個雪貂微衛星標記和30份雪貂DNA樣本，通過PCR擴增及STR掃描對雪貂群體遺傳多樣性加以分析和評估。

有效等位基因數是指理想群體中一個基因標記上產生與實際群體中相同純合度所需的等位基因數，有效等位基因數是反映群體遺傳變異程度的一個重要指標，如果有效等位基因數與絕對等位基因數越接近，表明該等位基因在群體內均勻分布度就越好，本文測得雪貂平均有效等位基因數為1.6686，平均觀察等位基因數，即絕對等位基因數為2，二者十分接近，說明這些微衛星位點的等位基因在被測雪貂群體的基因組中分布比較均勻，這或許與該群體采用“最佳避免近交法”的繁殖法有關。除了等位基因數，群體雜合度也是評估群體遺傳多樣性的重要指標，群體雜合度是反映群體雜合程度的度量單位，群體平均雜合度的高低反映了群體遺傳的一致性程度，群體雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越大，即遺傳多態性就越高。文中所測雪貂群體的觀測雜合度為0.32，期望雜合度0.34，平均雜合度0.33，這與澳大利亞人工養殖雪貂群的平均雜合度0.36，及美國人工養殖雪貂群體的平均雜合度0.31相比[2]，其遺傳結構特征及生產繁殖是相對合理的。

此外，多態信息含量(PIC)也是衡量群體遺傳多樣性的重要參數，PIC是用以描述微衛星基因標記多態性大小的量度單位，研究者Botstein等認為當基因標記PIC>0.5時，為高度多態位點，即表明該微衛星標記具有高度的可提供信息含量；當0.25

表1 雪貂微衛星位點信息Table.1 Information on domestic ferret microsatellite DNA markers

表2 21個微衛星標記對雪貂種群的檢測結果Table.2 The detected information on 21 microsatellite loci in laboratory domestic ferret

Hardy-Weinberg(HWE)平衡定律是指在一個群體無限大、個體間進行隨機交配、沒有突變、沒有遺傳漂變的情況下，群體內一個位點上的基因型頻率和基因頻率將世代保持不變，即處于遺傳平衡狀態。HWE檢驗P值>0.05時，表示該位點在群體中處于HWE平衡；當0.01

我們監測的群體是采取封閉群最佳避免近交繁殖法養殖的雪貂群體，其遺傳組成理論上應具有較高的雜合性，富有遺傳異質性及基因多態性。從本文PCR擴增結果可以看出(見圖1～2)，篩選、優化的21個微衛星標記，具有較強的遺傳信息含量，能夠較好地反映雪貂群體個體間的遺傳多樣性，STR掃描和軟件分析結果均顯示等位基因數在所測雪貂群體中分布較為均勻，群體的雜合度及遺傳一致性也相對穩定，尤其是多態信息含量(PIC)處于高度多態性范圍，并以此驗證了雪貂群體的遺傳多樣性。此外，Hardy-Weinberg檢驗P值也證實了雪貂群體處于遺傳平衡狀態。這些分析結果均反映了雪貂種群遺傳結構的現狀，為科學合理地評估雪貂群體的繁殖及遺傳檢測方法及標準的建立提供了基礎資料和依據。