腎復康Ⅵ號方對阿霉素腎病大鼠模型腎小球電荷屏障的影響

曹 歡，劉 芳，白曉紅，趙歷軍，汪 偉，管麗薔，劉詩洋

(1.遼寧中醫藥大學,沈陽 110300； 2.遼寧中醫藥大學附屬醫院,沈陽 110300)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是兒童腎臟疾病中發病率較高的疾病之一，臨床表現為大量蛋白尿(>3.5 g/d)，低蛋白血癥(血清白蛋白<30 g/L)，高脂血癥和不同程度的水腫[1]。根據其常見的臨床表現，中醫多按“水腫”來進行辯證論治，病機主要為肺脾腎三臟虛損[2]，導致水濕內停所致。腎復康Ⅵ號方是我院針對治療小兒難治性腎病而制定的協定方，以健脾益氣、清熱利濕、活血通絡為治則，既往研究表明其可提高腎病患兒血清皮質醇的水平，改善患兒整體狀態，減少糖皮質激素的用藥量及用藥時間[3]。本實驗通過建立急性阿霉素腎病大鼠模型,比較腎復康Ⅵ號方治療各組大鼠的的療效及對腎小球電荷屏障的影響，探討其治療急性阿霉素腎病大鼠模型的機制，為臨床治療腎病綜合征提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠60只,體重180～200 g,8周齡,由本溪長生實驗動物中心提供[SCXK(遼)2015-0001]。動物實驗和取材于遼寧中醫藥大學實驗動物中心進行[SYXK(遼)2013-0009]。福利倫理審查證號20151103。

1.2 藥物

腎復康Ⅵ號方：黃芪30 g、黨參15 g、石韋25 g、山藥20 g、黃柏10 g、水蛭5 g、丹參15 g等組成。(購自眾意愿大藥房，于遼寧中醫藥大學重大科研平臺實驗室制備為濃度為生藥2 g/mL的中藥溶液)；阿霉素粉針劑,浙江海正藥業有限公司(批號：150629，使用時配制為1 mg/mL的溶液)；醋酸潑尼松片，廣東華南藥業集團有限公司(批號：160302，使用時配制為1 mg/mL的溶液)。

1.3 主要試劑及儀器

尿液/腦脊液總蛋白診斷試劑盒、白蛋白檢測試劑盒(羅氏)；免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

RM2235手動石蠟切片機(萊卡)；BX51熒光顯微鏡(奧林巴斯)；全自動生化分析儀(Cobas-C8000型，羅氏)。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及模型制作

將60只大鼠隨機分為五組：正常組、阿霉素腎病模型組(模型組)、腎復康Ⅵ號方干預組(中藥組)、潑尼松干預組(潑尼松組)、腎復康Ⅵ號方+潑尼松干預組(結合組)，每組12只，分離飼養。根據楊維娜等[4]的造模方法進行改良，除正常組外均于試驗第1天尾靜脈注射給予阿霉素溶液0.6 mL/100 g，第7天再次尾靜脈注射阿霉素溶液0.4 mL/100 g，2次注射前后均需要用0.5 mL生理鹽水沖管，減少藥物在尾靜脈血管內滯留，減輕阿霉素導致尾部壞死的發生率。正常組在相同時間點注射同等量的生理鹽水。

1.4.2 給藥方法

造模第15天開始每天灌胃治療，連續4周。中藥組給予腎復康Ⅵ號方，根據體表面積換算中藥量為0.625 mL/100 mg；潑尼松組給予潑尼松溶液1 mL/100 g；結合組給予中藥量0.625 mL/100 mg和潑尼松溶液1 mL/100 g；正常組、模型組給予飲用水。

1.4.3 一般狀況

觀察大鼠的一般活動、精神狀態、大便形態、體重、尿量。

1.4.4 測定24 h尿蛋白定量

分別于造模第15天及給藥后的每周三早上8點，將大鼠放入金屬代謝籠內,到周四早上8點，收集24 h的尿液,記錄尿量，用免疫比濁法測定24 h尿蛋白定量。

1.4.5 血清白蛋白檢測

于給藥4周后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg麻醉后，腹主動脈取血，分離血清檢測白蛋白。

1.4.6 腎組織病理檢查

給藥4周后，留取腎組織放入10%中性福爾馬林中固定，經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片(厚度為4 μm)，脫蠟至水，HE、PAS染色，二甲苯透明，中性樹膠封固，觀察組織學病理變化。

1.4.7 免疫組化法檢測腎組織PCX、HSPG、HPA的表達

4 μm石蠟組織切片常規染色后按免疫組化試劑盒說明書操作，DAB顯色后中性樹膠封片，每只大鼠腎組織切片隨機選取5個區域攝片，應用JEOR801D形態學圖像分析系統軟件version1.0計算細胞內對應抗體陽性表達區域的平均光密度(OD)，結果呈棕黃色顆粒狀物質沉積表達為陽性。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 一般狀態觀察結果

正常組大鼠一般狀態均正常。其他組大鼠注射阿霉素后出現體重下降，大便稀，精神欠佳，尿量減少，毛色粗糙無光澤，活動減少，反應低下。部分大鼠出現陰囊水腫，腹水。各藥物干預組給藥后大鼠體重逐漸上升，一般狀態較模型組逐漸好轉。

2.2 24 h尿蛋白定量測定結果

給藥前，與正常組比較，模型組及各藥物干預組的24 h尿蛋白定量值明顯升高(P< 0.05)，各藥物干預組與模型組相比差異無顯著性(P> 0.05)。給藥后，模型組呈進行性升高，各藥物干預組對比同期模型組均明顯減少(P< 0.05)。與同期潑尼松組比較，中藥組較高，但只在給藥第4周差異有顯著性(P< 0.05)，結合組在給藥第2、3、4周均減少(P< 0.05)。(見表1)

2.3 各組大鼠血清白蛋白的變化

與正常組比較，各組血清白蛋白降低(P< 0.05)；與模型組相比較，各藥物干預組血清白蛋白略有升高，但差異無顯著性(P> 0.05)。(見表2)

2.4 腎組織病理改變

正常組腎小球腎小管結構正常，其余各組腎小球形態結構大致正常，模型組系膜細胞及基質輕度增生，其余各組系膜細胞及基質無明顯增生；模型組腎小管內可見蛋白管型，腎間質嚴重水腫，各藥物干預組腎小管蛋白管型及腎間質水腫程度比較：結合組<潑尼松<中藥組<模型組。(見圖1)

2.5 免疫組化法測腎組織PCX、HSPG、HPA的表達

正常組的PCX沿腎小球基底膜表達連續，而模型組的PCX表達斷裂不連續，與模型組比較，正常組和各藥物干預組的OD值均升高(P< 0.05)；中藥組較潑尼松組降低(P< 0.05)；潑尼松組與結合組比較差異無顯著性(P> 0.05)，(見圖2)。各組HSPG的OD值比較，其差異無顯著性(P> 0.05)(見圖3)。HPA在模型組的腎小球內皮及上皮細胞中大量表達，正常組微量表達；與模型組比較，正常組和各藥物干預組的OD值均降低(P< 0.05)；結合組較潑尼松組表達減少(P< 0.05)；中藥組與潑尼松組比較差異無顯著性(P> 0.05)(見圖4)。(見表3)

表1 各組24 h尿蛋白定量Table.1 Twenty-four-hour urinary protein in each group

注:與模型組比較,△P< 0.05；與潑尼松組比較,#P< 0.05；與正常組比較*P< 0.05。下同。

Note.Compared with the model group,△P< 0.05.Compared with the prednisone group,#P< 0.05.Compared with the normal group,*P< 0.05.The same below.

表2 各組大鼠末次給藥后血清白蛋白比較 Table.2 Comparison of serum ALB after the last administration in each group of rats

表3 各組大鼠PCX、HSPG、HPA平均光密度比較 Table.3 Comparison of average optical density of PCX, HSPG, and HPA in each group of rats

3 討論

阿霉素腎病大鼠模型是由Bertani等[5]在1982年創建的，造模的前4周為急性阿霉素腎病大鼠模型，病理改變類似于人的微小病變型(minimal change disease, MCD)[6]。本研究預實驗過程中采用1次尾靜脈注射阿霉素，大鼠耐受性差，尾靜脈壞死率高。故本實驗應用改良的阿霉素腎病大鼠模型[4]，分2次尾靜脈注射并且在注射前后沖管，降低了藥物對大鼠尾靜脈的損傷和死亡率。本研究造模第15天時測24 h尿蛋白定量，模型組及各藥物干預組的24 h尿蛋白定量均明顯高于正常組，提示造模成功。

對于腎病綜合征的治療，有研究表明90%以上的微小病變型患兒對糖皮質激素治療敏感，但本病的臨床復發率為60%[7]，對于復發患兒，糖皮質激素用量大，療程長，容易引起患兒免疫力下降，增加感染風險，同時增加高血壓、高血糖、骨質疏松、肥胖、肝腎功能受損等副作用的發生率[3,8-9]。對于這類患兒，中醫證型比較復雜，因病程較長，水濕內停日久，郁而化熱或復感外邪，外邪入里化熱，濕與熱相合導致濕熱內生，濕熱之邪具有粘滯、難以消除的致病特點，導致病程纏綿難愈；另一方面水濕內停日久，阻滯氣機，氣滯血瘀，瘀血又影響氣機運行，加重水濕，濕和瘀內留，導致氣機不行，水濕更難消解，則疾病處于惡性循環中[10]。我院多年來采用腎復康Ⅵ號方聯合糖皮質激素治療腎病綜合征，能夠縮短使用糖皮質激素的時間，減輕糖皮質激素的副作用，臨床療效確切[11]。本方以黃芪、黨參、石韋健脾化濕為君藥；蒼術、黃柏清熱利濕為臣藥；水蛭、丹參等活血破瘀為佐藥；山藥等健脾助運為使藥。諸藥合用，共奏健脾益氣、清熱利濕、活血通絡之效，達到標本兼治的目的。現代藥理研究表明，黃芪能夠保護腎小球濾過膜的分子屏障及電荷屏障，從而保護腎臟，減少蛋白流出[12]。水蛭可通過減少腎小球內免疫復合物的沉積，減少腎小球系膜細胞和細胞外基質的增生，從而減輕腎小球濾過膜的損傷[13]。本研究結果顯示各藥物干預組較同期模型組一般狀態好轉，24 h尿蛋白定量不同程度減少，提示潑尼松與腎復康Ⅵ號方均能改善大鼠一般狀態及不同程度的減少24 h尿蛋白含量。在改善24 h尿蛋白定量方面，中藥組的24 h尿蛋白定量在第4周明顯高于潑尼松龍組，但結合組在給藥第2、3、4周均較同期潑尼松組減少，值得注意的是在給藥4周時，模型組的24 h尿蛋白定量達到最高點，提示隨著尿蛋白定量增加，腎病變加重，單純應用中藥治療腎病綜合征的療效低于中西醫結合用藥。在腎組織病理改變方面，三個給藥組的病理改變均能不同程度減輕，提示腎復康Ⅵ號方可以改善腎病變程度。在血清白蛋白方面,各藥物干預組與模型組比較略升高，但差異無顯著性，可能與實驗時間較短有關。

注：(a)正常組；(b)模型組；(c)中藥組；(d)潑尼松組；(e)結合組。下同。圖1 腎組織蘇木精-伊丹紅染色Note.(a)Normal group;(b)Model group;(c)Chinese medicine group;(d)Prednisone group;(e)Combination group.The same below.Figure.1 Nephridial tissue hematoxylin-eosin staining

圖2 免疫組化法測腎組織PCX的表達Figure.2 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of PCX

圖4 免疫組化法測腎組織HPA的表達Figure.4 Immunohistochemical staining of renal tissue expression of HPA

阿霉素腎病大鼠模型的病理改變類似于人的微小病變型，而微小病變型是小兒腎病綜合征的主要類型，約占80%～90%[1，14]。大部分學者認為微小病變型中蛋白尿的產生與腎小球濾過膜上的電荷屏障受損有關[15]。電荷屏障上存在陰電荷，同性電荷相排斥，生理情況下，帶陰電荷的白蛋白幾乎不能通過腎小球電荷屏障，但是病理情況下，腎小球電荷屏障受損，其上陰電荷減少，部分帶陰電荷的白蛋白就可以通過腎小球濾過膜，從而出現高度選擇性蛋白尿。現代研究認為，足細胞特異性蛋白足盂蛋白(podocalyxin，PCX)和硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteo glycan，HSPG)是構成腎小球電荷屏障的主要成分[16]。PCX是最早被學者發現的，位于腎小球上皮細胞及內皮細胞被膜表面，一方面，因PCX帶有陰電荷，可防止相鄰足細胞間足突的粘附，以維持足突細胞形態的穩定性；另一方面，PCX帶有的陰電荷，能夠保證腎小球電荷屏障的完整性，防止帶有負電荷的蛋白分子通過腎小球濾過膜的電荷屏障漏入原尿中[17-19]。HSPG位于腎小球基底膜的內、外疏松層上，一方面可與腎小球基底膜中的膠原和層粘連蛋 白相互作用維持腎小球基底膜分子結構的完整性；另一方面HSPG的側鏈硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)帶有負電荷，被稱為腎小球基底膜上的陰離子位點，是構成腎小球基膜電荷屏障的重要成分[20]；而乙酰肝素酶(heparanase，HPA) 是一種內源性β-葡糖苷酸酶，能夠降解HSPG的側鏈HS，從而破壞腎小球的電荷屏障[21-23]。

本研究中有關電荷屏障的相關蛋白結果顯示，PCX表達各藥物干預組均高于模型組，中藥組較潑尼松組低，潑尼松組與結合組比較差異無顯著性；而HPA表達各藥物干預組均較模型組降低，結合組較潑尼松組減少，中藥組與潑尼松組差異無顯著性。說明腎復康Ⅵ號方與潑尼松治療阿霉素腎病大鼠的機制可能是通過上調PCX、降低HPA的表達，從而改善阿霉素腎病大鼠的電荷屏障，且腎復康Ⅵ號方聯合潑尼松對降低HPA表達的效果更佳。HSPG各組表達差異無顯著性，提示本研究的藥物治療作用可能與HSPG蛋白的表達不相關。