四種開竅藥對急性不完全性腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦保護作用

黃 麗，朱彩霞，張芹欣，方永奇，李 翎*

(1.廣州中醫藥大學,廣州 510405； 2.廣東省中醫院珠海醫院，廣東 珠海 519015； 3.廣州中醫藥大學第一附屬醫院,廣州 510405)

中風又稱腦卒中，分為缺血性中風和出血性中風，在我國以缺血性中風多發，具有高發病率，高致死率，高致殘率的特點[1-2]。目前，對于缺血性中風初期，首選溶栓治療恢復腦組織供血，但供血恢復后易繼發腦缺血再灌注損傷。中醫藥在治療腦病中有其獨特優勢，特別是以石菖蒲、冰片、蘇合香、麝香為代表的具有芳香走竄，開竅醒神之功的醒腦開竅藥。現代研究發現這四種開竅中藥，特別是其不同方法所提取的有效成分/部位作為單一藥物對腦損傷均有一定的保護作用，同時此類藥物在體內具有吸收快、分布快而廣泛，脂溶性強、能調節血腦屏障通透性，并促進其他藥物透過血腦屏障[3-6]，能維持腦興奮-抑制平衡、減輕腦損傷[7-9]等特點。但其藥效、藥理作用強弱不盡相同，目前缺乏該類藥物特別是有效成分、部位對腦損傷保護作用的比較研究以及對不同作用機制的探討。同時，腦缺血再灌注損傷的機制相互影響，錯綜復雜，有研究表明有關氧化應激反應的相關酶(SOD、MDA、GSH-PX)，血管活性物質(ET-1、CGRP)及凋亡基因bcl-2家族參與了腦缺血再灌注損傷病理級聯反應過程，是缺血性腦血管疾病病情演變及程度指標之一[10-13]，對治療腦缺血再灌注損傷疾病的藥物研究具有重要意義。

因此，本實驗利用急性不完全性腦缺血再灌注大鼠模型，對比研究四種開竅藥石菖蒲、冰片、麝香、蘇合香的有效成分/部位(β-細辛醚、冰片、麝香酮、蘇合香揮發油)在相同臨床等效劑量下對模型大鼠的作用，觀察此四種藥對模型大鼠腦組織含水量，自由基相關酶，ET-1，CGRP，bcl-2及bax的影響，以探討四種開竅藥的有效成分/部位對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護作用的強弱。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠，180～220 g，8周齡，雌雄各半，共120只，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心[SCXK(粵)2013-0034]。動物實驗于廣州中醫藥大學第一附屬醫院[SYXK(粵)2013-0092]，福利倫理審查表編號：TCMF1-2016008。

1.2 主要試劑與儀器

石菖蒲，康美藥業股份有限公司(批號140301)；β-細辛醚由廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心自制，純度為99.32%，配成1.70 g/L混懸液；冰片，康美藥業股份有限公司(批號151210181)，配成10.00 g/L混懸液；麝香酮，中國食品藥品檢定研究院(批號110719-201215)，配成0.04 g/L混懸液；蘇合香，亳州清逸中藥材有限公司(批號160415)；蘇合香揮發油由廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗中心自制，含量為1.0167%，配成0.20 g/L混懸液；SOD試劑盒(批號20160405)、MDA試劑盒(批號20160402)及GSH-PX試劑盒(批號20160331)均購自南京建成生物工程研究所；ET-1試劑盒(批號E116SC)、CGRP試劑盒(批號C154SC)均購自加拿大Elixir公司；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司；破膜劑(Cell Permeabilization Kit)購自美國Invitrogen公司；bcl-2抗體(貨號sc-7382)、bax抗體(貨號sc-7480)購自美國Santa公司。

AL204-IC電子分析天平(Mettler Toledo儀器上海有限公司)；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海-恒科學儀器有限公司)；TDL-5-A型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)；DK-8電熱恒溫水槽(上海一恒科技有限公司)；Multiskan Mk3型酶標儀(美國Thermo Scientific公司)；ALTRA型流式細胞儀美國(Beckman Coulter公司),激發波長488 nm,分析軟件expo32。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

適應性喂養這一周后隨機分為β-細辛醚組、麝香酮組、冰片組、蘇合香組、模型組、假手術組，每組20只。

1.3.2 急性不完全性腦缺血再灌注損傷模型的制備

大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，仰臥固定，頸部備皮，消毒，沿頸正中線做縱向皮膚切口，顯露雙側胸鎖乳突肌，鈍性分離，暴露雙側頸總動脈，并用動脈夾夾閉1 h后取出動脈夾再灌注，縫合、消毒。假手術組只暴露雙側頸總動脈，然后縫合、消毒。

1.3.3 給藥與取材

給藥組灌胃給藥7 d，每天2次，10 mL/g。假手術組、模型組給予相同體積生理鹽水，第7天給藥30 min后，制備急性不完全腦缺血再灌注損傷模型，再灌注24 h后，大鼠麻醉，腹主動脈采血后，快速斷頭取全腦，測腦含水量。

1.3.4 腦含水量的測定

取腦后稱濕重，85℃烤箱烘干24 h，迅速測干重，計算腦含水量。腦含水量%=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.5 SOD、MDA、GSH-Px、ET-1和CGRP的測定

取血清按試劑盒說明書操作分別用WST-1法測SOD 活力，TBA法測MDA 含量、GSH-Px活力，ELISA法測ET-1和CGRP含量。

1.3.6 bcl-2及bax的測定

將腦組織處理成單細胞懸液(約1×106)，加入封閉液(2% BSA)，渦旋后室溫放置15 min，搖勻后去上清液，再把單細胞懸液按破膜劑試劑盒操作，最后加1%多聚甲醛固定，流式細胞儀檢測。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 四種開竅藥對模型大鼠腦含水量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腦含水量增高(P< 0.01)，造模成功；與模型組比較，β-細辛醚組、冰片組、蘇合香組大鼠腦含水量降低(P< 0.05)，麝香酮組腦含水量有降低趨勢，但差異無顯著性。腦含水量比較：冰片組<蘇合香組<β-細辛醚組<麝香酮組。(見表 1)

表1 四種開竅藥對腦缺血再灌注大鼠腦含水量的影響Table.1 Effects of four types of resuscitation-inducing herbs on cerebral water content in model rats

注：與模型組比較，*P< 0.05,**P< 0.01；與假手術組比較，△P< 0.05，△△P< 0.01。下同。

Note.Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.Compared with the sham operation group，△P< 0.05，△△P< 0.01.The same below.

2.2 四種開竅藥對模型大鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX含量的影響

與假手術組比較，模型組SOD、GSH-PX含量降低(P< 0.05)，MDA含量升高(P< 0.01)。與模型組比較，冰片組、蘇合香組SOD含量提高(P< 0.05)；麝香酮組、蘇合香組MDA含量降低(P< 0.05)；β-細辛醚組、麝香酮組、冰片組、蘇合香組GSH-PX含量均有提高(P< 0.05)，蘇合香組<冰片組<β-細辛醚組<麝香酮組。(見表2)。

2.3 四種開竅藥對模型大鼠血中ET-1、CGRP含量的影響

與假手術組比較，模型組ET-1含量提高(P< 0.05)，CGRP的含量降低(P< 0.05)。與模型組比較，β-細辛醚組、麝香酮組、冰片組、蘇合香組ET-1含量均降低(P< 0.05)，麝香酮組<冰片組<蘇合香組<β-細辛醚組； CGRP的含量無顯著性差異(見表 3)。

2.4 四種開竅藥對模型大鼠腦組織中bcl-2及bax的影響

與假手術組比較，模型組bcl-2，bax蛋白含量提高(P< 0.01)，bcl-2/bax比值降低(P< 0.01)。與模型組比較，各藥物組bcl-2蛋白含量均提高(P< 0.05)，bax蛋白含量均減低(P< 0.05)，bcl-2/bax比值均提高(P< 0.05)，其作用強度麝香酮>冰片>蘇合香揮發油>β-細辛醚。(見表 4)

3 討論

醒腦開竅中藥治療腦病有突出優勢，現代研究表明β-細辛醚、麝香酮、冰片及蘇合香揮發油，多屬分子量小、高度親脂性的成分，既容易透過血腦屏障，又具有較強的神經藥理作用，是一類具有“辛香走竄”、“引藥上行”之性，以通關開竅、啟閉醒神為主要功效的中藥[14]，常用于腦損傷疾病的預防及治療。

表2 四種開竅藥對腦缺血再灌注大鼠血清SOD、MDA、GSH-PX含量的影響Table.2 SOD, MDA, and GSH-PX levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

表3 四種開竅藥對腦缺血再灌注大鼠血中ET-1、CGRP的影響Table.3 ET-1 and CGRP levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

表4 四種開竅藥對腦缺血再灌大鼠腦組織bcl-2、bax的影響Table.4 Bcl-2 and Bax levels for four types of resuscitation-inducing herb in model rats

腦水腫是急性腦缺血性損傷的主要病理變化之一。腦缺血初期為細胞毒性水腫[15-16]，缺血半小時產生續發性血管源性水腫[17]。缺血時間越長，腫脹越明顯，最終使血管腔狹窄，甚至堵塞，反過來又加重腦缺血[18]。其基本發病機制與細胞膜結構和功能改變，鈉泵功能減退，微血管通透性增高等相關。研究表明SOD、GSH-PX是體內重要的抗氧化酶，SOD能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，阻斷自由基的毒性反應，清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷[19]，GSH-PX特異地催化GSH對過氧化物的還原反應,能清除過氧化物代謝產物，阻斷脂質過氧化鏈鎖反應，從而起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[20]。本次研究中β-細辛醚、冰片、麝香酮及蘇合香揮發油均能不同程度降低模型大鼠腦水腫程度，其中以冰片作用最佳，其他三種用強弱程度分別是：蘇合香揮發油>β-細辛醚>麝香酮。同時，冰片、蘇合香揮發油可明顯升高血清中抗氧化酶SOD、GSH-PX含量，β-細辛醚組、麝香酮作用次之；麝香酮及蘇合香揮發油降低脂質過氧化產物MDA作用最強，說明四種開竅藥有效成分/部位均能降低腦水腫缺血再灌注損傷，其作用機制可能與減少自由基損傷，清除神經毒性相關。

ET-1、CGRP分布于中樞神經系統和血管內皮細胞中，分別具有強烈的舒縮血管作用。缺血、缺氧、再灌注損傷時，EI-1分泌增加可促進血管平滑肌收縮，加重腦組織缺血缺氧；能引起細胞內鈣離子增高,可間接激活NO合成酶，導致NO增多，發揮神經毒作用[21]。CGRP是內源性ET拮抗劑，能有效地防治組織的缺血再灌注損傷[22]。本研究中各藥物組均能有效降低ET-1含量，并具有增加CGRP趨勢，其中以β-細辛醚組降低ET-1作用最強，說明β-細辛醚對改善腦部微循環有顯著作用。

有研究證實CGRP可上調缺血再灌注腦組織bcl-2蛋白的表達，其神經保護和抗凋亡作用可能與其上調bcl-2蛋白表達有關[23]。bcl-2 與 bax 分別是 bcl-2 家族中最典型的凋亡抑制基因和凋亡誘導基因，用于多種器官缺血再灌注實驗研究的凋亡因子監測指標，如心肌[24]、腦組織[13]、肝腎[25]等，研究表明bcl-2在移植器官組織中高表達[26]，并且在這些組織器官的缺血再灌注實驗研究中發現bcl-2/bax組成的平衡體系的變化與細胞凋亡水平的變化相關，即bcl-2 蛋白表達增多、bax蛋白表達減少，則細胞凋亡水平下降；反之則細胞凋亡水平上升[27-28]。本次研究中β-細辛醚干預后的模型大鼠腦組織中的bcl-2蛋白表達升高，與本課題組前期劉林等[29]研究結果相同，說明β-細辛醚可能通過上調bcl-2和下調 bax的表達對腦缺血再灌注大鼠中樞神經元細胞的凋亡起到抑制作用。同時，麝香酮、冰片、蘇合香揮發油干預后的模型大鼠腦組織的bcl-2蛋白，bax蛋白的表達，bcl-2/bax比值趨勢與β-細辛醚一致，說明四種開竅藥可能均從抑制神經元細胞凋亡角度對模型大鼠腦損傷的起到保護作用，其抑制作用強度：麝香酮>冰片>蘇合香揮發油>β-細辛醚。

目前關于醒腦開竅藥的研究仍有局限性，闡明其治療神經系統疾病的作用機制，甚至發現新的促進藥物入腦的成分,具有重要的意義和應用前景，本研究通過對比四種醒腦開竅類中藥的有效成分/部位對急性不完全性腦缺血再灌注模型大鼠的治療作用，加強醒神開竅共性及不同點的研究。研究發現此四種藥物在腦缺血損傷中作用靶點可能不同，四藥對比，冰片在降低腦含水量方面作用最佳，蘇合香揮發油能有效減少氧化應激損傷，麝香酮可明顯增加bcl-2蛋白，降低bax蛋白，可能通過抑制腦細胞凋亡從而起到保護腦組織的作用，β-細辛醚作用居中，整體上四種開竅藥有效成分/部位對急性不完全性腦缺血再灌注模型大鼠均有保護作用，其作用機制可能與減少自由基生成，抑制脂質過氧化反應，改善微循環狀態，降低腦水腫程度，減少神經細胞凋亡有關，只是腦損傷保護的作用機制和各作用點強度不同，提示可針對臨床不同的腦損傷，分別選用相應的藥物治療。但本研究檢測指標數量有限，方法較單一，在后續研究中將對四種醒腦開竅藥治療神經系統疾病的作用機制進行深入的研究與探討。