miR-206過表達靶向VEGFA對人肝癌HepG2細胞侵襲和遷移的抑制作用

王小明，余 珊，趙曉姬

(1.攀枝花市中心醫院消化內科，四川 攀枝花 617067； 2.綿陽市第三人民醫院檢驗科 四川省精神衛生中心，四川 綿陽 621000)

據統計2015年全世界新增肝癌病例85.4萬，發病率第六位；肝癌死亡病例84萬，死亡率第四位[1]。目前對早期肝癌的治療一般采用外科手術進行部分切除或者進行肝臟移植再結合術后的輔助性治療；對中后期的肝癌患者只能采取化療，免疫療法及靶向治療等[2]。靶向治療是一種新興的治療方法，尋找合適的靶點對靶向治療至關重要。小RNA(MicroRNAs, miRs)是一類短的非編碼RNA，長度僅為22個核苷酸左右，會影響基因表達的轉錄后調控。目前發現許多在肝癌中異常表達的miRs，這些miRs在肝癌的發生發展中發揮著重要作用，有望成為靶向治療的靶點[3-4]。深入研究miRs在肝癌中的作用對肝癌的治療具有重要意義。本研究的主要目的是探索miR-20在人肝癌HepG2細胞侵襲和遷移中的功能。

1 材料和方法

1.1 細胞

人肝癌細胞系HepG2來源于ATCC (American Type Culture Collection)。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清及轉染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司；RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連Takara公司；載體pcDNA3.1-EGFP購自Biofeng；熒光素酶檢測試劑盒來源于Promega公司；Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司；抗血管內皮生長因子A (vascular endothelial growth factor A, VEGFA)抗體、抗波形蛋白(vimentin)抗體、抗N-鈣粘蛋白(N-cadherin)抗體和抗纖維連接蛋白(fibronectin)抗體購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養分組與轉染

HepG2細胞于含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基，并置于37℃ 5% CO2的恒溫培養箱中培養。當細胞增殖到約80%進行傳代。通過轉染miR-206 mimic過表達miR-206，轉染pc-VEGFA過表達VEGFA。HepG2細胞分為四組：HepG2 組(對照組)，miR-206 mimic組，pc-VEGFA組和miR-206 mimic+pc-VEGFA組。按照轉染試劑TurboFect Transfection Regent的說明書向HepG2細胞單獨或同時轉染miR-206 mimic和pc-VEGFA過表達載體。

1.3.2 qRT-PCR擴增分析

用RNA提取試劑盒提取總RNA，然后反轉成cDNA，最后進行PCR，miR-206上游引物：5’-CAGATCCGATTGGAATGTAAGG-3’，miR-206下游引物：5’-ATGC TTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3’。VEGFA上游引物：5-’CCAGCAGAAAGAG GAAAGAGGTAG-3’，VEGFA下游引物：5’-CCCCAAAAGCAGGTCACTCAC-3’。

根據SYBR Premix Ex TaqTM說明書進行qRT-PCR，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.3.3 熒光素酶實驗

首先用洗滌液洗滌待測細胞，棄去洗滌液后在孔中加入1倍的細胞裂解液將細胞裂解。室溫下，振蕩器上振蕩5～10 min，移入離心管中進行離心，3000 r/min 5 min，離心后取上清進行發光測定。按照試劑盒說明書和儀器操作說明對待測樣品進行發光值測定。

1.3.4 Western blot檢測VEGFA，抗波形蛋白，N-鈣粘蛋白和纖維連接蛋白的表達

用PBS清洗待測細胞3次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜。5%的BSA封閉1 h，再加入相應的一抗，4℃過夜孵育，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統計灰度值計算相對表達量。

1.3.5 Transwell檢測細胞侵襲

首先用無血清的培養基將待測細胞制成1×106個/mL的細胞懸液，然后將細胞懸液加入鋪有人工基底膜的transwell的上室中，同時在下室中加入含20%胎牛血清的培養基。37℃培養24 h后，用0.5%的結晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽除去上室內側的細胞。顯微鏡下觀察并統計細胞數量。

1.3.6 劃痕檢測細胞遷移

待測細胞制成1×106個/mL的細胞懸液后加入6孔板中，過夜培養至形成單層細胞。在單層細胞上用10 μL的槍頭劃橫線，PBS洗3次以洗去因劃痕而脫落的細胞。顯微鏡下拍照測量劃痕寬度，培養24 h后再取出拍照測量劃痕寬度。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 miR-206 mimic對肝癌細胞HepG2中miR-206表達的影響

由圖1可知，轉染mimic-scramble后HepG2細胞中miR-206表達沒有明顯變化。轉染miR-206 mimic后HepG2細胞中miR-206表達顯著上升(P< 0.001)。由此可見，miR-206 mimic可顯著增強HepG2細胞中miR-206的表達。

注：與對照組比較，***P < 0.001。圖1 qRT-PCR檢測HepG2細胞中miR-206表達Note.Compared with the control group，***P < 0.001.Figure.1 qRT-PCR detection of miR-206 expression in HepG2 cells

2.2 miR-206過表達對HepG2細胞VEGFA的mRNA水平的影響

如圖2所示，轉染mimic-scramble不會影響VEGFA的mRNA水平。轉染miR-206 mimic會顯著降低VEGFA的mRNA水平(P< 0.001)。以上結果說明，miR-206過表達可減弱HepG2細胞VEGFA的mRNA水平。

注：與對照組比較，***P < 0.001。圖2 qRT-PCR檢測HepG2細胞中VEGFA的mRNA水平Note.Compared with the control group，***P < 0.001.Figure.2 qRT-PCR detection of VEGFA mRNA levels in HepG2 cells

2.3 miR-206與VEGFA的靶向關系

生物信息學預測顯示miR-206可直接靶向VEGFA，利用熒光素酶實驗驗證miR-206與VEGFA的靶向關系。如圖3所示，向VEGFA野生型的細胞中轉染miR-206 mimic后熒光素酶活性顯著下降(P< 0.01)。但向VEGFA突變型的細胞中轉染miR-206 mimic后熒光素酶活性卻沒有明顯變化。上述結果表明，miR-206與VEGFA存在直接靶向關系。

注：+：添加；-：不添加； 與VEGFA野生型的細胞比，**P<0.01.圖3 熒光素酶實驗檢測miR-206與VEGFA的靶向關系Note. +:Add.-:Not add.Compared with the VEGFA wildtype cells,**P<0.01. Figure.3 Luciferase assay to detect the targeted relationship between miR-206 and VEGFA

2.4 miR-206對VEGFA表達的影響

由圖4可知，miR-206 mimic組VEGFA的蛋白水平顯著低于對照組(P< 0.01)。pc-VEGFA組VEGFA的蛋白水平顯著高于對照組(P< 0.01)。與pc-VEGFA組相比，miR-206 mimic+pc-VEGFA組VEGFA的蛋白水平顯著降低(P< 0.01)。由此可見，miR-206負向調控VEGFA表達。

2.5 miR-206過表達靶向VEGFA對HepG2細胞侵襲的影響

如圖5所示，miR-206 mimic組每個視野下的侵襲細胞數目顯著少于對照組(P< 0.01)。pc-VEGFA組每個視野下的侵襲細胞數目顯著多于對照組(P< 0.01)。與pc-VEGFA組相比，miR-206 mimic+pc-VEGFA組每個視野下的侵襲細胞數目顯著下降(P< 0.01)。以上結果說明，miR-206過表達可通過靶向VEGFA減弱HepG2細胞侵襲。

2.6 miR-206過表達靶向VEGFA對HepG2細胞遷移的影響

圖6顯示，miR-206 mimic組劃痕愈合率顯著低于對照組(P< 0.01)。pc-VEGFA組劃痕愈合率顯著高于對照組P< 0.01)。與pc-VEGFA組相比，miR-206 mimic+pc-VEGFA組劃痕愈合率顯著降低(P< 0.01)。上述結果表明，miR-206過表達可通過靶向VEGFA抑制HepG2細胞遷移。

注：與對照組比較，**P<0.01；與pc-VEGFA組比較，##P < 0.01。圖4 蛋白印記檢測VEGFA的蛋白水平Note.Compared with the control group，**P < 0.01. Compared with the pc-VEGFA group，##P < 0.01.Figure.4 Protein imprinting to detect protein levels of VEGFA

注：與對照組比較，**P < 0.01；與pc-VEGFA組比較，##P < 0.01。圖5 Transwell檢測細胞侵襲Note.Compared with the control group，**P < 0.01. Compared with the pc-VEGFA group，##P < 0.01.Figure.5 Transwell assay for the detection of cell invasion

2.7 miR-206過表達靶向VEGFA對HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白表達的影響

由圖7可知，miR-206 mimic組vimentin, N-cadherin和Fibronectin表達低于對照組(P< 0.01)。pc-VEGFA組vimentin, N-cadherin和Fibronectin表達高于對照組(P< 0.01)。與pc-VEGFA組相比，miR-206 mimic+pc-VEGFA組vimentin, N-cadherin和Fibronectin表達降低。由此可見，miR-206過表達可通過靶向VEGFA減弱HepG2細胞上皮間質轉化相關蛋白vimentin, N-cadherin和Fibronectin表達。

3 討論

隨著分子生物學的發展和非編碼RNA的發現，microRNAs受到越來越多的關注。大量研究表明microRNAs的異常表達常與包括癌癥在內的各類疾病相關。這些microRNAs在癌癥的發展進程中起著重要作用，會影響所有的生物學過程[5-6]。越來越多的文獻報道microRNAs可通過靶向目標基因的方式調控癌細胞的增殖，凋亡，侵襲及遷移等[7-8]。miR-206作為一種獨立的預后因素，在癌癥中的作用受到了越來越多研究者的青睞[1,2,9-10]。

大量研究表明miR-206在調控細胞侵襲和遷移方面發揮著重要作用。有數據顯示miR-206可直接靶向FMNL2降低結腸直腸癌細胞侵襲[11]。Zhang等[12]發現在非小細胞肺癌中，miR-206與SOX9存在直接靶向，可抑制細胞侵襲。據報道miR-206可通過靶向ANXA2和KRAS減弱胰腺癌細胞侵襲[13]。有數據顯示在腎細胞癌中miR-206可靶向GAK降低細胞遷移能力[14]。Huang等[15]發現miR-206可負向調控YRDC抑制膀胱癌細胞遷移。有研究發現在乳腺癌中過表達miR-206可通過靶向PFKFB3抑制細胞遷移[16]。

注：與對照組比較，**P < 0.01；與pc-VEGFA組比較，##P < 0.01。圖6 劃痕實驗分析細胞遷移Note.Compared with the control group，**P < 0.01. Compared with the pc-VEGFA group，##P < 0.01.Figure.6 Scratch test analysis of cell migration

注：與對照組比較，**P < 0.01；與pc-VEGFA組比較，##P < 0.01。圖7 Western blot檢測上皮間質轉化相關蛋白表達Note.Compared with the control group，**P < 0.01. Compared with the pc-VEGFA group，##P < 0.01.Figure.7 Western blot analysis of epithelial-mesenchymal transition-related protein expression

越來越多的文獻報道肝癌中也存在許多可以調控細胞侵襲和遷移的microRNAs。有研究表明在肝癌細胞中，miR-625可直接靶向IGF2BP1降低細胞侵襲[17]。Liu等[18]發現miR-141與Tiam1存在直接靶向，可抑制肝癌細胞侵襲。Li等[19]發現在肝癌細胞LM3中，miR-26b與EphA2存在直接靶向關系，可降低細胞遷移。有數據顯示在肝癌細胞Huh7和HepG2中，miR-150-5p可直接靶向MMP-14減弱細胞遷移[20]。

本研究表明，在肝癌細胞HepG2中，miR-206與VEGFA存在直接靶向關系，負向調控VEGFA表達；miR-206過表達可通過靶向VEGFA抑制細胞侵襲和遷移，減弱上皮間質轉化相關蛋白vimentin, N-cadherin和Fibronectin表達。下一步將通過體內實驗研究miR-206在肝癌的發生發展過程中的功能及其機制，為尋找肝癌的治療靶點奠定基礎。