一種快速獲得Vav1基因敲除穩定細胞系的方法

郭 果，李賽超，王 麗，劉 璐，盧燎勛,2*，黃 蓉,2*

(1.新鄉醫學院醫學檢驗學院，河南 新鄉 453000； 2.河南省免疫與靶向藥物重點實驗室 河南省分子診斷與醫學檢驗技術協同創新中心，河南 新鄉 453000； 3.臨床檢驗診斷學河南省研究生創新實踐基地，河南 新鄉 453000)

隨著基因敲除技術的發展，特別是對ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術的深入研究，其在植物、動物和微生物等領域的應用也愈發成熟[1, 5, 7, 8, 10, 12, 16-19]。其中CRISPR/Cas9系統由于載體構建簡單，敲除效率高，所以也被廣范應用于各種細胞系的基因敲除[6, 11, 14, 20]。傳統的利用CRISPR/Cas9系統進行細胞系基因敲除需要借助于抗生素篩選得到單克隆細胞，其耗時久，效率低，不能在短時間內獲得足夠多的單克隆細胞。而在得到單細胞克隆以后，由于CRISPR/Cas9系統的固有特性，其對基因組DNA進行剪切常在切割位點形成少數幾個堿基的缺失或是插入，不能通過普通的凝膠電泳直接檢測出這種變化所造成的差異。而常規的檢測方法如直接測序法可以獲得關于突變體非常詳細的信息，但是其周期長，操作繁瑣，不能大規模應用；PCR酶切檢測法極度依賴切割位點附近是否有可用的酶切位點，適用范圍非常狹窄；T7E1酶切檢測法靈敏度不夠高，需要多個步驟進行操作，而且T7E1酶價格昂貴，不適合進行大規模篩選；PAGE電泳檢測法步驟繁瑣，試劑昂貴，費時費力；高分辨率溶解曲線檢測法(high-resolution melting (HRM) analysis)僅僅只能檢測是否有突變，不能得到堿基插入或是缺失的具體數目[9, 13, 21]。綜上所述，這些傳統方法都不能同時快速獲得大量單細胞克隆和準確的對突變體進行檢測。流式細胞儀的分選功能可以將目標細胞進行單克隆分選，保證每一個培養孔中只含有一個細胞，能在短時間內獲得大量單克隆細胞；由于熒光PCR具有分辨率高、操作簡便和成本低廉等特點，其已經被廣泛應用于SNP檢測、基因型檢測等領域[3-4]，盡管已經有研究報道將其應用于單克隆細胞基因型檢測[2, 15]，但是在實際應用中，如何在短時間內高效地對單克隆細胞樣本進行批量處理，以獲得基因組DNA進行后續分析，還有待解決。

本研究中將CRISPR/Cas9基因編輯系統、流式細胞儀單克隆分選技術、熒光PCR技術和大批量DNA樣本處理技術結合起來，在B16小鼠黑色素瘤細胞中獲得大量Vav1基因敲除的單克隆細胞。

1 材料和方法

1.1 細胞

B16小鼠黑色素瘤細胞購于中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑及儀器

BbsI限制性內切酶(NEB)；T4 DNA連接酶(NEB)；pX458(Addgene)；脂質體Lipofectamine 3000(Life)；減血清培養基Opti-MEM(Hyclone)；Hi-DiTMFormamide(Applied Biosystems)；Taq酶(Vazyme)。

PCR儀(Eppendorf)；NanoDrop2000超微量分光光度計(Thermo)；ABI測序儀3730(Applied Biosystems)；流式細胞儀分選儀(BD fusion)。

1.3 實驗方法

1.3.1 打靶位點選擇和引物合成

針對小鼠Vav1基因，在小鼠基因組數據庫Ensembl(http://asia.ensembl.org)中找到小鼠Vav1基因DNA序列，然后使用在線設計軟件http://crispr.mit.edu/，在小鼠Vav1基因的靶位點exon5內挑選2個特異性位點作為sgRNA的靶序列，這兩個靶序列分別為：Vav1-sgRNA1：CTACGAGGACCTAATGCGCTTGG，Vav1-sgRNA2：CGAGGACCTT TATGACTGCG TGG。根據選定的sgRNA靶序列，設計2對共4條引物序列，并在引物序列的5’端添加BbsI酶切位點(下劃線代表酶切位點)：M-Vav1-IVT-1：CACCGCTACGAGGACCTAATGCGCT；M-Vav1-IVT-2：AAACAGCGCATTAGGTCCTCGTAGC；M-Vav1-IVT-3：CACCGCGAGGACCTTTATGACTGCG和M-Vav1-IVT-4：AAACCGCAGTCATAAAGGTCC TCGC(上海百力格生物技術有限公司合成)。

1.3.2 載體構建

首先將4條引物以M-Vav1-IVT-1+M-Vav1-IVT-2和M-Vav1-IVT-3+M-Vav1-IVT-4的組合方式通過退火配對獲得帶有粘性末端的雙鏈DNA片段，具體程序如下：首先將合成的兩對引物分別磷酸化，磷酸化反應體系為，引物M-Vav1-IVT-1+M-Vav1-IVT-2和M-Vav1-IVT-3+M-Vav1-IVT-4各加入1 μL (100 μmol/L)，再加入1 μL 10×T4 Ligation Buffer (NEB)，然后加入0.5 μL T4 Polynucleotide Kinase (NEB M0201S)，最后加入6.5 μL ddH2O至總體積10 μL。配制好反應體系以后，充分混勻，置于37℃孵育30 min；取出以上反應產物，轉移至PCR儀中進行變性和退火，反應程序如下：95℃ 5 min; 95℃～25℃ at -5℃/min。利用BbsI限制性內切酶將載體(PX458)DNA線性化，純化回收PX458載體DNA；3 μL 10×NEB Buffer 2.1；1 μL BbsI (NEB)最后補水至總體積30 μL，置于37℃孵育2 h。酶切完成以后純化酶切產物并回收至30 μL ddH2O中。最后通過連接反應、轉化、重組子篩選獲得完整的sgRNA和Cas9表達載體：加入0.5 μL帶有粘性末端的雙鏈DNA片段和2 μL具有相同粘性末端的載體DNA，再加入0.5 μL T4 DNA連接酶(NEB M0202S)和1 μL 10×T4 ligation Buffer (NEB)，反應1 h后轉化大腸桿菌DH5α并涂布氨芐青霉素抗性平板，置于37℃培養箱進行過夜培養，第2天下午挑選單菌落進行測序驗證，即可得到sgRNA和Cas9表達載體PX458-Vav1-1和PX458-Vav1-2。

1.3.3 質粒DNA轉染B16細胞系

將構建好的表達載體PX458-Vav1-1和PX458-Vav1-2質粒DNA等質量混合，通過脂質體介導的轉染方式轉染B16小鼠黑色素瘤細胞。B16細胞接種到24孔板上培養24 h用于轉染實驗。將PX458-Vav1-1和PX458-Vav1-2載體質粒DNA各取1.5 μg，兩種質粒共計3 μg加入到150 μL減血清培養基(Opti-MEM)中進行稀釋；取0.75 μL脂質體Lipofectamine 3000稀釋于150 μL減血清培養基(Opti-MEM)中，然后將脂質體稀釋液加入至DNA稀釋液中，充分混勻，置于室溫條件下孵育20 min。將上述步驟中已接種培養細胞的24孔板中的培養基棄去，然后將復合物按順序分別加入相應的細胞中，每孔加入300 μL。所有細胞在37℃ 5%濃度CO2培養箱中孵育1.5 h后，棄去培養基，更換新鮮的培養基繼續培養。

1.3.4 流式細胞儀分選獲得單細胞克隆

轉染40～80 h后，棄去培養基，采用胰酶消化法將細胞重懸于含有500 μL新鮮培養基的離心管中，1350 r/min離心5 min，丟棄大部分培養基上清，留約200 μL培養基于管底，用移液器輕輕吹打混勻，再加400 μL新鮮培養基混勻后轉移至流式管中。為了獲得穩定的突變單克隆細胞，通過流式細胞儀將GFP陽性單細胞分選至已經加有150 μL新鮮培養基的96孔細胞培養板中。培養14 d后，將單克隆轉移至48孔細胞培養板中繼續擴大培養并做后續分析。

1.3.5 裂解細胞獲取DNA溶液PCR擴增包含有打靶位點的DNA序列

取少量細胞，離心力1500 r/min，離心時間5 min，棄去上清液，保留底部細胞，加入20 μL細胞裂解液，(細胞裂解液配方為：100 mmol/L Kcl，20 mmol/L Tris-Hcl pH 9.0，0.3% Triton X-100，1.0 mg/mL proteinase K)，使用移液器將細胞吹打混勻，加入礦物油覆蓋細胞裂解液， 55℃孵育15 min，使細胞充分裂解，再轉移至95℃，孵育10 min，使蛋白酶K變性，處理完以后的裂解液即可作為PCR模板使用，置于-20℃保存備用。

1.3.6 利用PCR擴增包含有打靶位點的DNA序列

首先使用在線引物設計軟件primer3(http://primer3.ut.ee/)，針對打靶位點基因組序列設計特異性引物，Vav1-f PCR-F:TGGCCTGAATC TGTCCCCTA(上游引物5’端進行FAM熒光標記)和Vav1-f PCR-R:GCAGCCATCTCTACCCTTCC，(上海百力格生物科技有限公司合成)；通過PCR擴增包含打靶位點目的片段，體系為：(Vazyme，P111)2×Taq Master PCR MIX：10 μL，Vav1-F PCR-F(5 μmol/L)和Vav1-F PCR-R(5 μmol/L)各0.5 μL；細胞裂解液DNA：2 μL；補充ddH2O至總體積20 μL；程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃30 s，72℃40 s；72℃10 min；35個循環。電泳檢測PCR產物，如果有清晰DNA條帶，則取2 μL PCR產物，稀釋200倍，用于后續分析。

1.3.7 利用熒光PCR技術檢測單細胞克隆基因型

按照：Hi-DiTMFormamide：9 μL；PCR產物(步驟1.3.6中獲得)：0.5 μL；標準分子量內參DNA：0.5 μL比例進行混合。將混合物置于PCR儀上，按照：95℃ 10 min；4℃ 10 min進行變性反應。完成后，置于ABI測序儀3730(Applied Biosystems)上進行毛細管電泳。最后采用Genemapper ? ID software v3.2軟件分析數據，根據標準分子量內參DNA的片段大小直接確定檢測樣本PCR產物的堿基數，通過與野生型對照樣本的PCR產物堿基數進行比較，可以準確反映每個單克隆細胞插入或缺失的堿基數目。

圖1 Vav1基因sgRNA設計與載體構建Figure.1 Design and construction of Vav1 gene sgRNA

圖2 流式檢測GFP在B16細胞的表達Figure.2 Flow cytometry of GFP expression in B16 cells after transfection

1.3.8 測序驗證單細胞克隆基因型

選取部分確定已經敲除了Vav1基因的樣本，利用和1.3.6中相同的引物序列(其中上游引物去掉5’端FAM熒光標記，命名為Vav1-f PCR-F-1)進行PCR擴增，將PCR產物進行TA克隆，挑取單克隆進行培養，然后送測序，驗證其堿基缺失或插入等信息。

2 結果

2.1 打靶位點設計和載體構建

根據軟件設計結果，最終在小鼠Vav1基因的靶位點exon5內挑選2個特異性位點作為sgRNA的靶序列，其位置分布和序列見圖1a。經過連接反應，將兩條sgRNA分別連接進入PX458載體中，通過進一步的測序驗證，發現兩條sgRNA已經連接進入載體中，而且序列和插入方向完全正確(圖1b和圖1c)。

2.2 流式細胞儀進行單細胞分選

選擇流式細胞儀分選儀(BD fusion)的FITC通道，用同一細胞系轉染了無GFP質粒的細胞做陰性對照，設置閾值，即可準確將GFP陽性細胞群分離出來。如圖2所示，脂質體轉染3 d后GFP陽性率為12.5%。

2.3 通過熒光PCR檢測GFP陽性單細胞基因型

圖3 熒光PCR檢測GFP陽性單細胞基因型Figure.3 Genotyping a GFP-positive single cell by fluorescence PCR

經過擴大培養以后，從分選得到的GFP陽性單細胞中，隨機挑選16個，通過熒光PCR對其基因型進行檢測。如圖3所示，共檢測了16個GFP陽性單細胞，其中14個基因敲除，2個野生型，敲除效率為87.5%(14/16)；在發生了基因敲除的14個單細胞克隆中，有2個有單峰，12個有雙峰，而且14個單細胞克隆缺失的堿基數目均不同，表明其基因型具有多樣性；在具有雙峰的12個單細胞克隆中，13號單細胞克隆有一個峰與野生型相比，缺失了1個堿基，7號和9號單細胞克隆的2個峰之間均只有1個堿基的差異。以上結果表明：(1)通過對GFP陽性單細胞進行分選，是一種有效地對發生了基因敲除的陽性細胞群進行富集的手段；(2)CRISPR/Cas9系統對打靶位點的切割具有隨機性；(3)利用熒光PCR檢測單細胞基因型具有很高的靈敏度和準確性，即使1個堿基的差異變化都可以精確的檢測出來。

2.4 測序驗證單細胞克隆基因型

為了驗證通過熒光PCR進行基因型檢測的準確性和可靠性，本研究選取了3個經過熒光PCR驗證過的陽性克隆進行測序檢測，如圖4b所示，2號單細胞克隆的4個打靶位點均發生了基因組編輯，其中一條染色體上的2個打靶位點分別缺失27和7個堿基，另一條染色體上的2個打靶位點分別缺失9和3個堿基，這一結果與熒光PCR的檢測結果中出現的兩個分別缺失12和缺失32個堿基的峰一致；3號單細胞克隆熒光PCR檢測結果表明其兩條染色體分別缺失了30和55個堿基，通過測序結果分析可以看出，其4個打靶位點均發生了基因組編輯，其中一條染色體上的2個打靶位點分別缺失3和27個堿基，另一條染色體上的2個打靶位點同時進行了切割，導致發生了55個堿基丟失的大片段刪除，兩種方法得到的結果也是相同的(圖4c)；5號單細胞克隆經熒光PCR檢測的結果顯示其具有單一峰，即兩條染色體均發生了51個堿基的剪切，分析測序結果發現其兩條染色體的4個打靶位點均同時發生了切割，這就造成此單克隆只有一種基因型，即在2個打靶位點之間缺失55個堿基。以上結果表明，經過測序得到的基因型結果和通過熒光PCR檢測得到的基因型結果完全吻合，顯示了利用熒光PCR檢測單細胞基因型具有良好的準確性和可靠性。

圖4 陽性克隆測序結果與熒光PCR比對Figure.4 Comparative fluorescence PCR and Sanger sequencing of representative Vav1 knockout clones

3 討論

CRISPR/Cas9系統由于具有簡單易用、剪切效率高等特點，在短短幾年時間內已經得到了廣泛推廣和應用[22]，但是在利用其對細胞系進行基因敲除的過程中，有一些問題亟待解決：(1)傳統的細胞系轉染以后，需要借助抗性進行篩選來獲取單克隆，費時費力；(2)獲得單細胞克隆以后，需要使用試劑盒進行DNA抽提，工作量大，成本昂貴；(3)對單細胞克隆進行基因型鑒定時，由于CRISPR Cas9系統的固有特性，其對基因組DNA進行剪切以后，常在切割位點形成少數幾個堿基的缺失或是插入，而常規的檢測方法如直接測序法、PCR酶切檢測法、T7E1酶切檢測法、PAGE電泳檢測法、高分辨率溶解曲線檢測法等，由于檢測精度不夠或是操作難度大等原因，都不能同時快速和準確的對突變體進行檢測。以上這些原因導致利用CRISPR/Cas9系統對細胞系進行基因敲除經常需要耗費很長時間，而且難以獲得足夠多不同基因型的單細胞克隆用于后續研究。

本研究中將CRISPR/Cas9基因編輯系統、流式細胞儀單克隆分選技術、熒光PCR技術和大批量DNA樣本處理技術結合，可以在短時間內獲得大量陽性單克隆細胞，這種對陽性單克隆細胞的富集可以有效解決傳統方法中篩選難的問題。在獲得陽性單克隆細胞以后，本研究采用直接裂解法可快速獲得基因組DNA，結合熒光PCR技術，在短時間內對多個基因敲除單克隆細胞進行基因型鑒定。

相比于傳統的細胞系基因敲除方法，本研究首次將流式細胞儀分選功能、熒光報告蛋白、DNA直接裂解法和熒光PCR技術高效結合，開創性地解決了傳統細胞系敲除中的一系列問題，其具有以下優點：(1)此方法不需要借助抗性篩選，而是直接利用流式細胞儀分選功能對熒光蛋白陽性細胞群進行篩選，可以在最短時間內獲得大量的陽性單克隆細胞，這也為后續從中挑選不同基因型的單細胞打下了良好基礎；(2)此方法不需要使用試劑盒抽提基因組DNA，對細胞的處理時間只需要25 min，可以在短時間內對大批量樣本進行集中處理，極大地節省了經濟和時間成本；(3)此方法靈敏度和精確度極高，只需要極少量DNA即可，而且可準確檢測1個堿基的差異；(4)此方法無應用范圍限制，檢測目標區域不需要有特定酶切位點的存在；(5)此方法因為不涉及DNA抽提，對樣本進行PCR以后經過簡單的稀釋、變性和毛細管電泳即可以檢測分析，步驟簡便，所以適合大規模批量化操作；(6)此方法具有通用性，沒有細胞系或是特定基因的應用限制。

基于以上優點，本研究所提出的快速獲得Vav1基因敲除穩定細胞系的方法可以進行推廣，可在B16小鼠黑色素瘤細胞中快速獲得大量Vav1基因敲除穩定單克隆細胞，為細胞系基因敲除提供了一種簡單、高效、可行的方法，也為細胞系基因敲除提供了新的思路。