在豬油體系中模擬茶葉籽油酚類物質和VE在貯藏過程中的抗氧化活性及相互作用關系

劉國艷，徐 鑫，劉 莉，張 潔，莊林武，金青哲，王興國，張 暉,*

茶葉籽油作為一種新興的可食用植物油脂，不飽和脂肪酸含量達80%以上，其中多不飽和脂肪酸含量約25%左右，是大多數植物油的2 倍[1-3]。油脂的不飽和程度與氧化酸敗呈正相關，但茶葉籽油在常溫條件下保存1～2 a后品質良好，氧化穩定性較高[4-5]，這應與其中酚類、甾醇、角鯊烯、VE等天然抗氧化活性成分有關[6-7]。茶葉籽油中酚類物質主要包括沒食子兒茶素、兒茶素、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、咖啡酸、沒食子酸酯、山柰酚、肉桂酸、槲皮素、沒食子酸、咖啡酸、蘆丁、槲皮素等[8-10]。酚類物質和VE均具有較強的抗氧化效果[11-12]，但二者之間在不同含量和結構組成時可能存在多種抗氧化相互作用類型，在茶葉籽油中天然存在的這兩類物質的抗氧化能力和相互作用關系鮮見報道。由于多數食用植物油中源于次生代謝的活性物質含量豐富且種類繁多，在一般的植物油體系中，研究上述物質對脂肪酸組成復雜的植物油氧化穩定性的影響及相互作用關系存在諸多困難。而豬油的脂肪酸組成相對簡單，且自身存在的抗氧化成分極少，本研究以其作為參考體系，模擬茶葉籽油自身所含有的酚類物質和VE在油脂加速氧化過程中的抗氧化能力及相互作用關系，避免因復雜的脂肪酸組成及其他抗氧化活性物質帶來的干擾，旨在研明富含不飽和脂肪酸的茶葉籽油具有強氧化穩定性的機理，為茶葉籽油適度精煉提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉籽 云南隨縣洪山鎮云霧山茶場；豬板油市售。

VE（α-生育酚，純度＞96%） 美國Sigma-Aldrich公司；蘆丁標準品 南京替斯艾么中藥技術研究所；異丙醇、正己烷、甲醇、石油醚、冰醋酸（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；UV 1000紫外-可見分光光度計 天美科技有限公司；EYELA MG-2200氮吹儀、EYELA N-1200B旋轉蒸發儀東京理化器械株式會社；FW 100高速粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；D2F-6020真空干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉籽油制備

茶葉籽烘干后粉碎，加入正己烷，料液比為1∶10（g/mL），采用超聲波輔助提取法，超聲功率280 W，20 min后45 ℃水浴攪拌，提取1.5 h，旋轉蒸發去除溶劑。

1.3.2 豬油制備

稱取一定量的豬板油，清洗干凈后于絞肉機中攪碎，置于燒杯中按料液比1∶4（g/mL）加水混勻，于90 ℃水浴20 min，8 000 r/min離心30 min，取上層豬油樣品。

1.3.3 茶葉籽油酚類物質的制備

稱取1 kg茶葉籽油于10 L反應釜中，加異丙醇（料液比1∶1（g/mL）），300 r/min混勻，加甲醇（料液比1∶5（g/mL）），混勻，于50 ℃水浴萃取30 min，混勻，靜置1 h，從反應釜放料口排去下層，將上清液50 ℃旋轉蒸發至2 L，按照上述步驟重復萃取3 次，合并3 次上清液，50 ℃旋轉蒸發去除溶劑。

脫脂處理：取上述樣品10 g，用甲醇定容至150 mL，再加入300 mL的正己烷脫脂，靜置30 min，取下層，萃取3 次，合并3 次萃取液，50 ℃旋干。按照上述方法多次制備并混勻，測定其總酚含量。

1.3.4 常溫氧化實驗

稱取300 g茶葉籽油于封口透明錐形瓶，置于室溫避光貯藏12 個月，每隔30 d測一次油樣的過氧化值和酸值，以過氧化值和酸值上升速率來衡量茶葉籽油的貯藏穩定性。

1.3.5 恒溫加速氧化實驗

采用Schaal法（63±1）℃烘箱加速氧化，對不同組的油樣進行為期一個月的油脂氧化穩定性實驗，每隔12 h攪拌1 次，每隔3 d取一次樣，每次取樣5.0 g，測定各氧化指標及活性成分含量。

實驗分5 組進行，每組樣品具體如下：

茶葉籽油組：稱取400 g茶葉籽油于棕色錐形瓶，敞口避光置于烘箱；豬油組：稱取400 g豬油于棕色錐形瓶，敞口避光置于烘箱；豬油＋VE組：稱取400 g豬油＋VE（α-生育酚標準品）0.112 g于棕色錐形瓶，使得VE含量為382 mg/kg（依據茶葉籽油中VE實際含量），敞口避光置于烘箱；豬油＋酚類物質組：稱取400 g豬油＋茶葉籽油酚類物質于棕色錐形瓶，使得總酚含量為530 mg/kg（依據茶葉籽油中酚類物質實際含量），敞口避光置于烘箱；豬油＋VE＋酚類物質組：稱取400 g豬油＋茶葉籽油酚類物質＋VE（α-生育酚標準品）0.112 g，于棕色錐形瓶，使得總酚和VE含量分別為530、382 mg/kg，敞口避光置于烘箱。

1.3.6 氧化指標的測定

過氧化值：依據GB/T 5538—2005《動植物油脂過氧化值測定》測定[13]；酸值：依據GB/T 5530—2005《動植物油脂酸值和酸度測定》測定[14]；茴香胺值：依據GB/T 24304—2009《動植物油脂茴香胺值的測定》測定[15]；丙二醛含量：依據GB/T 5009.181—2003《豬油中丙二醛的測定》測定[16]。

1.3.7 活性成分測定

采用福林-酚法[17]測定總酚含量：1 g油樣（茶葉籽油或豬油）溶于1 mL異丙醇，加5 mL甲醇50 ℃浸提30 min，8 000 r/min離心5 min，重復萃取3 次，合并上清液，40 ℃條件下氮氣吹干，用100%甲醇定容至5 mL后取1 mL與1 mL福林-酚試劑混合，加入3 mL 7.5% Na2CO3于室溫條件下靜置反應1 h，于波長765 nm測定吸光度。以沒食子酸做標準曲線。

VE含量的測定參照文獻[18]，并略作修改。取1.0 g樣品油，精確至0.001 g，正己烷定容至10 mL，取VE混標0.01 g定容至10 mL，進行高效液相色譜分析。

高效液相色譜條件：Waters Spherisorb Silica色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：正己烷-異丙醇（98.5∶1.5，V/V）溶液；流速1 mL/min；進樣量10 μL；柱溫25 ℃；紫外檢測器；檢測波長295 nm。

1.3.8 酚類物質與VE相互作用類型

根據過氧化值，確定誘導時間、傳播時間，進而計算協同價，相關計算方法如下[19-23]：

誘導時間、傳播時間的計算：油脂氧化反應在動力學上屬于一級反應，反應方程為：-dc/dt=kc，進行積分推導得方程：lnc=-kt＋lnc0。其中c為過氧化值（mmol/kg），k為速率常數，c0為起始油樣的過氧化值（mmol/kg）。令y=lnc、x=t，進行回歸計算，即可得到（63±1）℃條件下各油樣的回歸方程。作圖法確定空白組的氧化誘導時間IPA，根據方程確定此時的過氧化值CA。選定空白組的過氧化值達某一固定值CB，此時的時間減去誘導時間IPB。其余組別根據上述方程求出樣品的過氧化值達到CA時所需的時間，即為誘導時間，過氧化值達到CB的時間減去IPA即為傳播時間IPB。

協同價按下式計算：

式中：S為協同價；A1、A2為酚類物質和VE；S小于0表示A1和A2呈拮抗作用，數值越小，代表拮抗作用越強；S等于0表示A1和A2為加和作用；S大于0表示A1和A2呈協同作用，數值越大，代表協同作用越強；若IPA1=IP0，且IPA2≠IPA1＋A2≠IP0，則A1對A2起增效作用；若IPA1=IP0，且IPA2=IPA1＋A2≠IP0，則A1與A2無作用。

1.4 數據統計分析

采用SPSS Statistics 19.0軟件進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 茶葉籽油常溫貯藏穩定性分析

過氧化值主要反映油脂氧化的初級階段，是用來測定油脂在貯藏過程中氧化的初級產物量[24-26]，過氧化值國家標準為6 mmol/kg。酸值主要表示油脂中游離脂肪酸的含量，油脂在貯藏過程中發生水解或熱裂解反應從而導致游離脂肪酸的增加，GB/T 2716—2005《食用植物油衛生標準》對食用植物油有統一的最高限量標準，即食用植物油成品油酸值不大于3 mg/g，植物原油的酸值不大于4 mg/g[27]。如圖1所示，茶葉籽油過氧化值、酸值隨著貯藏時間的延長逐漸增加，茶葉籽油過氧化值在4月和8月時出現下降的現象，這是因為過氧化值反映的是油脂中氫過氧化物的含量，氫過氧化物由油脂中的不飽和酯在氧化過程中形成，性質極不穩定，易進一步分解形成醛、酮、酸等小分子物質，這意味著油脂氧化形成氫過氧化物的同時也伴隨著氫過氧化物的分解，是一個動態過程，由此推測在這兩段時間里，茶葉籽油中氫過氧化物進行降解反應速度大于生成速度，所以出現了過氧化值下降的現象[28]。12 個月后過氧化值和酸值分別達3.27 mmol/kg和1.78 mg/g，均在安全質量范圍之內。徐莉等[29]測定橄欖油常溫條件下貯藏35 d時過氧化值為5 mmol/kg；呂艷春等[30]測定了大豆毛油常溫貯藏5 個月后過氧化值達14 mmol/kg。與上述植物油相比，茶葉籽油在常溫條件下表現出較強的耐貯性，這可能是源于其富含酚類、VE、甾醇等活性抗氧化物質。其中酚類及VE在油脂氧化穩定性方面貢獻突出，而關于這2 種物質的抗氧化能力及相互作用關系則需進一步探討。

圖1 常溫貯藏條件下茶葉籽油過氧化值和酸值的變化Fig. 1 Changes in peroxide value and acid value of tea seed oil during storage at room temperature

2.2 茶葉籽油酚類物質和VE的抗氧化活性及相互作用分析

2.2.1 茶葉籽油和豬油的活性成分及理化指標

表1 茶葉籽油和豬油各活性成分與理化指標Table 1 Physicochemical properties and bioactive components of tea seed oil and lard

如表1所示，茶葉籽油中總酚與VE含量較高，極可能是茶葉籽油中的主要天然抗氧化劑，賦予茶葉籽油較強的抗氧化能力，抑制或延緩不飽和脂肪酸的氧化酸敗，成為茶葉籽油耐貯性強的本質原因。然而，茶葉籽油酚類物質組成非常復雜，會干擾其對茶葉籽油抗氧化效果的測定。豬油中總酚與VE等天然抗氧化成分含量較低，體系較簡單。因此，以豬油為研究體系，采用Schaal法（63±1）℃烘箱加速氧化，進行后續實驗。

2.2.2 加速氧化過程中茶葉籽油和豬油的氧化穩定性分析

表2 加速氧化過程中茶葉籽油和豬油的氧化指標變化Table 2 Change in oxidation indexes of tea seed oil and lard during accelerated oxidation

茴香胺值和丙二醛含量能很好地反映油脂氧化程度[31-32]。但丙二醛主要用于動物油脂氧化穩定性的測定，尤其用于反映豬油的氧化酸敗程度，因此未對茶葉籽油進行丙二醛含量的分析。由表2可知，在加速氧化過程中，茶葉籽油和豬油的各氧化指標均隨時間的延長逐漸上升，但豬油的上升速率要顯著高于茶葉籽油，在加速氧化30 d后，豬油過氧化值是茶葉籽油的5.41 倍，茴香胺值是茶葉籽油的1.51 倍。結合表1可以看出，茶葉籽油總酚和VE的含量分別是豬油的16.33 倍和3.83 倍，因此推測茶葉籽油較好的氧化穩定性與其具有較高含量的活性物質密切相關。由于豬油中活性物質含量較低，因此以豬油為載體，探究茶葉籽油中酚類物質和VE對豬油氧化穩定性的影響及二者的相互作用類型，可有效降低油脂中原有活性物質的干擾。

2.2.3 加速氧化過程中VE對油脂氧化穩定性的影響

由表3可知，在添加VE后，豬油的氧化穩定性顯著提高，加速氧化30 d后過氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了72.97%、3.83%、54.62%、47.83%。結合表4的相關性分析可進一步證明VE對油脂氧化穩定性具有重要貢獻。

表3 加速氧化過程中添加VE的豬油氧化指標及VE含量變化Table 3 Changes in oxidation indexes and VE content of lard with added VE during accelerated oxidation

表4 VE與各氧化指標的相關性分析Table 4 Correlation analysis of VE with each oxidation index

2.2.4 加速氧化過程中酚類物質對油脂氧化穩定性的影響

表5 加速氧化過程中添加酚類物質的豬油氧化指標及總酚含量變化Table 5 Changes in oxidation indexes and polyphenol content of lardwith added polyphenols during accelerated oxidation

由表5可知，在添加茶葉籽油酚類物質后，豬油的氧化穩定性較空白組和添加VE組均有顯著提高。加速氧化30 d后過氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了80.54%、2.87%、72.26%、71.74%，對比添加VE組可知，酚類物質抑制油脂氧化產物的生成效果明顯高于VE，尤其在抑制二級氧化產物的生成上貢獻突出，可能是因為VE分子中芳香烴環上只有一個氫被羥基取代，而酚類物質中有多個羥基，且酚類物質比VE多2 個苯環，酚類物質分子被氧化后產生的自由基間也會互相作用，生成新的酚型化合物，發揮抗氧化功能，故其抗氧化能力相對于VE會更強[33-36]。表6的相關性分析進一步證明油脂的氧化穩定性與茶葉籽油酚類物質尤其是酚類物質的含量密切相關。

表6 酚類物質與各氧化指標的相關性分析Table 6 Correlation analysis of polyphenols with each oxidation index

2.2.5 加速氧化過程中VE和酚類物質共同存在對油脂氧化穩定性的影響

表7 加速氧化過程中添加VE和酚類物質的豬油氧化指標及VE和總酚含量變化Table 7 Changes in oxidation indexes, VE, polyphenols of lard with addition of VE and polyphenols during accelerated oxidation

表8 VE、酚類物質與各氧化指標的相關性分析Table 8 Correlation analysis of VE and polyphenols with each oxidation index

由表7可知，加速氧化30 d后過氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了92.97%、6.22%、80.20%、80.43%，表明二者同時添加后，氧化產物的生成得到顯著抑制，與分別添加相比，抗氧化能力顯著增強。結合表8的相關性分析，與VE相比，酚類物質與各氧化指標的相關系數較大，表明其抗氧化貢獻越大。

2.2.6 VE和酚類物質抗氧化相互作用分析

作空白豬油組過氧化值與時間的關系圖，通過雙切線法求得其氧化誘導時間為14.72 d。油脂氧化反應在動力學上屬于一級反應。作油脂的ln（1/POV）-t圖，求得一級反應速率常數k和相關系數（R2）。空白豬油組的一級反應速率常數k為0.132 8，R2=0.913 9；豬油＋VE組的一級反應速率常數k為0.088，R2=0.949 8；豬油＋酚類物質組的一級反應速率常數k為0.064 3，R2=0.953 4；豬油＋VE＋酚類物質組的一級反應速率常數k為0.044 6，R2=0.989 1。根據方程確定此時的過氧化值CA為14.98 mmol/kg，其余組別根據上述方程求出樣品的過氧化值達到CA時所需的時間，即為誘導時間，豬油＋VE組的氧化誘導時間為21.59 d；豬油＋酚類物質組的氧化誘導時間為31.42 d；豬油＋VE＋酚類物質組的氧化誘導時間為49.78 d。IP0=14.72 d，IPA1=21.59 d，IPA2=31.42 d，IPA1＋A2=49.78 d。求得S為48.75%，S大于0表示A1和A2呈協同作用，數值越大，代表協同作用越強。由此可知，在豬油恒溫加速氧化過程中，VE與茶葉籽油酚類物質呈協同作用。

3 結 論

在室溫條件下貯藏1 a，茶葉籽油酸值和過氧化值上升非常緩慢，表明茶葉籽油品質穩定，耐貯性強。在此過程中，茶葉籽油酚類物質和VE含量緩慢下降表明它們參與了抑制油脂自動氧化過程，但并未被大量消耗。在模擬茶葉籽油中酚類物質和VE在豬油氧化穩定性實驗中發現，隨著氧化時間的延長，各組豬油的過氧化值、酸值、茴香胺值都逐漸增加，同時，VE和總酚含量逐漸下降，在加速氧化前期，氧化指標上升緩慢，活性成分含量迅速下降，氧化后期氧化指標迅速上升，活性成分含量下降趨勢變緩，各氧化指標的上升趨勢與活性成分的下降趨勢基本一致，二者呈現顯著的負相關性。豬油添加VE后的氧化穩定性顯著提高，加速氧化30 d后過氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了72.97%、3.83%、54.62%、47.83%；在添加酚類物質后，加速氧化30 d后過氧化值、酸值、茴香胺值、丙二醛含量與空白組豬油相比分別下降了80.54%、2.87%、72.26%、71.74%，不同組別的氧化指標上升趨勢：豬油＞豬油＋VE＞豬油＋酚類物質＞豬油＋VE＋酚類物質。結果表明，茶葉籽油酚類物質和VE都能大幅度延緩豬油的氧化酸敗，表現出很強的抗氧化活性，且茶葉籽油酚類物質抗氧化效果優于VE。經相互作用分析，在豬油恒溫加速氧化過程中，VE與茶葉籽油酚類物質呈協同作用。以豬油代替其他油脂模擬油脂自身活性成分對其氧化穩定性的影響及相互作用關系，盡可能避免油脂中其他活性成分的干擾，為油脂氧化穩定性的相關研究提供方法學參考。由于茶葉籽油中酚類物質種類復雜，其內在的抗氧化作用機制及相互作用關系還有待深入研究。