補骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉小鼠腸道功能的保護作用

汪慶飛，高家榮,2，邢亞群，孫祥瑞

(1.蚌埠醫學院第二附屬醫院藥劑科，安徽 蚌埠 233003；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031)

泄瀉，是指糞便稀薄、排便次數增加，甚至瀉出如稀水樣而言。泄為大便溏薄而緩者，瀉為大便清稀如水直下者。本病在一年四季均可發生，但以夏秋兩季多見，與臨床常見的慢性腹瀉較相似。作為臨床常見的癥狀，病因很多，如現代醫學的慢性菌痢、腸易激綜合征、胰原性慢性腹瀉、潰瘍性結腸炎、腸結核、腸道念珠菌病、腸功能紊亂、腸道腫瘤、結腸過敏、糖尿病腹瀉、藥源性腹瀉等。在治療慢性腹瀉方面，中醫有較好的療效，特別是中藥復方制劑，靶點多，可總體調節機體腸道功能，臨床應用前景廣泛。“二神丸”出自宋·許叔微的《普濟本事方》，以補骨脂和肉豆蔻組成，具有溫腎暖脾，澀腸止瀉之功效，是臨床治療脾虛泄瀉的基礎方。補骨脂性味：辛、苦、溫。歸經：入腎、脾經。功能：溫腎助陽、納氣止瀉。主治：腎虛，冷瀉，遺尿，滑精，小便頻數，陽痿，腰膝冷痛，虛寒喘嗽。豆蔻性味：辛、溫。歸經：入脾、胃、大腸經。功能：溫中下氣，澀腸止瀉。主治：虛寒氣滯，虛瀉冷痢，脘腹冷痛，嘔吐，以及腸滑不固，積食不化等癥。

本研究旨在探討補骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉腸道的保護作用，利用現代藥學的研究方法，即以文獻為基礎進行實驗研究，采用HE染色法、生化法等多種方法，從小鼠的一般狀態、胃腸激素等多方面進一步證實補骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉的作用，以便選取更安全、有效、嚴謹的藥物劑量、配伍，為臨床治療提供實驗參考依據。

1 材料與方法

1.1藥物補骨脂：安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：20141212；肉豆蔻：安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：20140625；參苓白術散：山西華康藥業股份有限公司，批號：20150905；生大黃：產地甘肅，批號：150401；補骨脂-肉豆蔻藥對的制備：取補骨脂-肉豆蔻(2 ∶1)藥材，加60%乙醇，8倍用量，每次提取1 h，提取2次，合并藥液，濃縮，配制成1.05、0.7、0.35 g·mL-1藥液備用。本研究起止時間為2015年12月17日至2016年1月11日，符合一般實驗動物倫理學要求。

1.2動物昆明小鼠，SPF級，安徽醫科大學(合肥)動物實驗中心供給，準字號：SCXK(皖)2011-002。室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，自由飲水飲食。

1.3主要儀器與試劑4%多聚甲醛，批號20121113，購自北京索萊寶科技有限公司。PBS緩沖液，批號：20110807144，購自谷歌生物公司。無水乙醇，批號20110301，購自國藥控股化學試劑有限公司。RM2016病理切片機，購自上海徠卡儀器有限公司。JB-P5包埋機購自武漢俊杰電子有限公司。

1.4方法

1.4.1模型復制 昆明種小鼠，雌雄各半，適應性飼養1周。將小鼠按隨機區組法隨機分正常組、模型組、補骨脂肉豆蔻藥對組(21.06、14.04、7.02 g·kg-1)組、參苓白術散組(2.34 g·kg-1)，每組10只。苦寒瀉下法，除正常組按規定每天用蒸餾水灌胃外，其余五組均用100%生大黃水煎劑(含原生藥1 g·mL-1)0.2 g/10 g，每日1次，連續8 d，造成脾虛泄瀉模型。觀察小鼠腹瀉或脫肛后，治療組給予補骨脂肉豆蔻藥對(21.06 g·kg-1)、補骨脂肉豆蔻藥對(14.04 g·kg-1)、補骨脂肉豆蔻藥對(7.02 g·kg-1)和參苓白術散(2.34 g·kg-1)灌胃，正常組和模型組給予等量溶媒，每天1次，連續給藥2周。

1.4.2一般形態學觀察 觀察各組小白鼠的一般體征，如體質量、毛色、神志、活動頻率等情況。

1.4.3腸推進試驗方法 末次給藥后，每只給予30%印度墨汁0.2 mL灌胃，20 min后，處死小鼠，剖腹，取出小腸(十二指腸始端到回盲部)，平放于桌面的白紙上，記錄墨汁在腸道中前行的距離以及小腸總長度，用墨水在腸道中前行距離與小腸總長度的比值，作為小腸推進百分率來評價。

推進率(%)=碳素墨水在小腸內推進距離(cm)/小腸全長(cm)×100%。

1.4.4結腸病理組織學觀察 取相對固定部位的結腸組織，置于4%多聚甲醛液中保存固定，2 d后依次進行常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE 染色、再次脫水、再次透明、封片，光鏡觀察，攝片保存，最后進行組織形態學分析。

1.4.5淀粉酶含量測定 末次給藥后，眼球取血，離心制備血清，按照淀粉酶測定試劑盒說明書要求，應用比色測定法測定血清淀粉酶含量。

1.4.6D-木糖的含量測定 由于尿液收集難度較大，常采用測定血清D-木糖。用百分濃度3% D-木糖溶液給灌胃，按說明書要求劑量灌服3% D-木糖溶液，大約60 min后眼球取血，離心制備血清，參照D-木糖試劑盒說明書，采用比色法檢測各組血清D-木糖含量。

2 結果

2.1一般情況造模前，各組的體質量差異無統計學意義；造模7 d后模型組相繼出現飲水、食欲下降，便溏，毛色不整，體質量減輕，倦怠，嗜臥等癥狀。給藥前，與正常組相比，其余各組體質量明顯減小(P<0.01)；給藥2周后，與模型組相比，補骨脂-肉豆蔻藥對(21.06 、14.04 g·kg-1)體質量增加差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2補骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉模型腸推進率影響與正常組相比，模型組墨汁推進率顯著增高(P<0.01)，提示脾虛泄瀉結腸運動增強；與模型組相比，給藥2周后，補骨脂-肉豆蔻藥對(21.06 g·kg-1)能明顯降低墨汁推進率(P<0.05)，提示其能降低脾虛泄瀉的結腸運動，參苓白術散組有類似的療效，見表2。

表1 補骨脂-肉豆蔻藥對對小鼠體質量的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

2.3結腸病理組織學觀察HE染色結果顯示：與正常組比較，模型組出現結腸膜萎縮變薄，腺體細胞增生，層次增多排列紊亂，并伴有大量炎細胞潤。與模型組相比，補骨脂-肉豆蔻藥對則明顯減輕了上述癥狀，炎細胞浸潤減少，腺體排列規則，結構清楚；提示補骨脂-肉豆蔻藥對對腸黏膜修復及炎性病理改善有一定的效果(見圖1)。

2.4酶活性檢測(生化法)D-木糖、淀粉酶的含量與正常組相比，模型組血清中D-木糖和淀粉酶的含量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，給藥2周后，補骨脂-肉豆蔻藥對組(14.04 g·kg-1、21.06 g·kg-1)能不同程度的升高血清中D-木糖和淀粉酶的含量(P<0.05 或P<0.01)，結果見表3。

3 討論

泄瀉是醫院門診常見的一種疾病，泄是指便稀薄，間斷發作，來勢緩者；瀉指大便直下，如水傾注，來勢急者。二者統稱為泄瀉。最早《黃帝內經》[1]稱為泄，有“洞泄”“濡泄”之說。漢唐以后稱為“下利”，直到宋代才稱為“泄瀉”。泄瀉的病因較為復雜，如寒瀉、熱瀉、虛瀉、濕瀉、食瀉等。其中虛瀉又包括脾虛瀉、腎虛瀉。而脾虛泄瀉是由于脾虛濕盛，困厄脾胃，致運化異常，又稱濡泄。臨床常見癥狀[2]大便稀薄，時停時瀉，完谷不化，略進油膩食物，則便次增多，腹脹不適，飲食減少，面黃，體無力，舌淡苔白，脈弱。雖然該證一般認為是大便溏薄，但有時臨床常見癥狀是大便先溏后干，或者是先干后溏，或者是干溏結合，不可認為都是溏浠狀[3]。該證為脾不健運時稱之為脾陽虛。脾的功能調節需脾陽和脾陰共同完成，缺一不可。脾主運化，多指脾陽的作用，但須有脾陰的協同，二者相輔相成，缺一不可。同時，脾胃互為表里，脾升清與胃降濁的平衡調節是維持臟腑氣機暢通，水谷精微正常吸收、分布、代謝的前提條件。脾虛氣陷，清陽當升不升，濕濁不化，則清濁雜混而下，遂成泄瀉之癥狀。由此可知脾虛濕盛是導致該證的首要病因[4]。自20世紀80年代以來，有關脾虛泄瀉證實質研究主要從脾主運化展開。普遍研究認為，脾虛泄瀉主要臨床表現為淀粉酶活性降低，D-木糖排泄率下降，胃腸功能紊亂，胃腸道激素異常等[5]。楊維益等[6]發現血清中的淀粉酶及胰脂肪酶活性也有不同程度的降低。脾虛還表現為免疫功能降低，副交感神經功能亢進，腸道二群感染等[7]。許多傳統中草藥在治療脾虛泄瀉證中發揮著極其重要的作用，如中藥復方制劑“益糖康”可以減少脾虛泄瀉小鼠血清炎癥因子的表達、“四君子湯”能夠減輕大鼠的脾虛泄瀉癥狀以及中藥“神曲”有調整脾虛泄瀉小鼠腸道菌群及保護腸黏膜的作用等。

表2 給藥治療2周后對腸推進試驗的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05

表3 補骨脂-肉豆蔻藥對對脾虛泄瀉血清中D-木糖和淀粉酶含量的影響

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01，cP<0.05

“二神丸”出自宋·許叔微的《普濟本事方》[8]，由補骨脂和肉豆蔻組成。補骨脂為豆科植物，性味辛、溫、微苦，歸腎脾經，具有溫腎助陽、納氣止瀉之療效。歷代中醫常用于治腎虛，冷瀉、瘡瘍、遺尿、滑精、陽痿、水腫、尿頻，脾胃虛弱，腰膝酸痛，虛寒喘嗽。補骨脂中含有很多活性組分[9-11]，主要有香豆素，如補骨脂素和異補骨脂素)，擬雌內酯類(如補骨脂定)，黃酮類，酚萜類(如補骨脂酚)化合物等。臨床應用：用于盜汗、冷痢，如慢性結腸炎、腸結核等;用于健胃，對有脾胃虛寒、鼓腸、腹脹、腸鳴腹痛者較為適宜。近些年來，大量的藥理學研究還發現，補骨脂還具有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、抗抑郁、治療骨質疏松、治療白癜風、治療銀屑病、治療血管性癡呆、性激素樣作用、增強免疫功能等多重作用。

肉豆蔻是肉豆蔻科肉豆蔻屬植物肉豆蔻的干燥成熟種仁[12-14]。肉豆蔻性味：辛、溫。歸經：入脾、胃、大腸經。功能：溫中下氣，澀腸止瀉[15]，主治：長尾虛寒氣滯，虛瀉冷痢，脘腹冷痛，嘔吐，以及腸滑不固，積食不化等癥。臨床應用：用于盜汗、冷痢，如慢性結腸炎、腸結核等;用于健胃，對有脾胃虛寒、食欲不振、腹痛、腹脹、腸鳴音亢進者較適宜。補骨脂-肉豆蔻醇提物是治療脾虛泄瀉的傳統古方， 但是文獻資料研究多為對該方組成藥物補骨脂、肉豆蔻的單味藥物研究，對于復方的研究很少，且極少數研究其組方劑量對藥效的產生的影響，并且復方對于治療脾虛的作用研究及其機制也尚不明確。因此本研究重點探討了“補骨脂-肉豆蔻醇提物”復方在大黃誘導小鼠脾虛泄瀉模型中發揮的作用及其潛在的機制。

本研究表明補骨脂-肉豆蔻醇提物有如下功能：補骨脂-肉豆蔻醇提物有明顯的止瀉作用，并且能明顯提高脾虛泄瀉小鼠體重、降低小鼠腸推進率、對腹瀉小鼠的腸黏膜修復及炎性病理改善有一定的效果。

綜上所述，從胃腸功能角度來研究補骨脂-肉豆蔻醇提物對脾虛泄瀉小鼠的作用機理得到證實，提示補骨脂-肉豆蔻醇提物有保護腸黏膜的作用，且通過對其機制的研究，為今后治療脾虛泄瀉提供了潛在的靶點。

(本文圖1見插圖9-1)