上調Klotho基因表達對心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響

張瑞萍，劉福壘

(1.洛陽市第一人民醫院檢驗科，河南 洛陽 471002；2.泰安市中心醫院，山東 泰安 271000)

心肌重構作為心臟在多種心血管疾病后的一種代償性病理過程，是導致患者心力衰竭甚至死亡的重要因素[1]，而心肌纖維化在心肌重構中扮演重要角色[2]。因此，如何有效防治心肌纖維化已成為心內科研究重點。Klotho作為一種抗衰老基因，在多種生理病理過程中扮演重要角色，Klotho表達缺失會導致一系列與衰老類似的功能紊亂，如骨質疏松、動脈粥樣硬化、炎癥、免疫功能異常、皮膚衰老等[3]。Corsetti等[4]研究指出，Klotho基因及表達產物與心血管疾病及其各種危險因素密切相關。田倪妮等[5]研究也認為，慢性心力衰竭患者心肌組織中Klotho基因表達減少。本研究通過構建大鼠心肌梗死模型，并轉導外源性腺病毒重組Klotho基因，觀察其對心肌梗死大鼠心功能及心肌纖維化的影響，以期為心肌梗死引起心肌纖維化的相關機制研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體質量(210±10)g，購自河南省實驗動物中心，合格證號：SCXK(豫)2010-0002。飼養于標準環境下，自由飲水、進食，實驗前預適應環境至少7 d。利用隨機數字表法將大鼠分為假手術組、模型組、Klotho轉染組和空白質粒組，每組15只。本研究起止時間為2016年12月至2017年1月，符合一般實驗動物倫理學要求。

1.1.2主要試劑和設備 慢病毒載體、pDC316-T載體和pDC316-mCMV-EGFP載體質粒(美國Stratagene公司)，總RNA提取試劑盒(Trizol法，美國Invitrogen公司)，逆轉錄、PCR試劑盒、加A尾試劑盒、EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶(日本TaKaRa公司)，2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)(上海聯碩生物科技有限公司)， Klotho、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、結締組織生長因子(CTGF)及內參引物序列(上海吉瑪制藥技術有限公司)，Klotho兔多克隆抗體和兔抗大鼠TGF-β 多克隆抗體(美國Abcam公司)，兔抗大鼠CTGF 多克隆抗體(美國 SantaCruz公司)，免疫組織化學試劑盒(北京中衫金橋生物技術有限公司)，Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物技術公司)，生物機能實驗系統(北京東西儀科技有限公司)，小動物呼吸機(上海玉研科學儀器有限公司)，實時熒光定量PCR儀和凝膠成像系統(美國Bio-rad公司)。

1.2方法

1.2.1Klotho基因重組腺病毒載體構建 利用總RNA提取試劑盒(Trizol法)對大鼠新鮮腎臟組織中總RNA進行提取，根據GeneBank中大鼠Klotho基因序列(收錄號：NM_021748.1)設計Klotho基因特異性引物：上游：5′-GGGAAGCTTGCTGCGCGGGAG-CCAGGCTCCGGGGC-3′，下游：5′-GGCCTCGAGTG-CTAATATATGCTGGCTGGAGTTGG-3′。利用逆轉錄試劑盒以Klotho基因特異性引物下游為模板逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，對Klotho基因序列進行RT-PCR。利用加A尾試劑盒對擴增產物進行加A尾后，與pDC316-T載體連接，利用EcoR Ⅰ 和Xho Ⅰ 限制酶進行雙酶切，并進行基因測序鑒定。提取測序正確的質粒，利用EcoR Ⅰ和XhoⅠ限制酶進行雙酶切后，克隆至pDC316-mCMV-EGFP載體質粒，在與慢病毒載體混合、同源重組、酶切后，制備攜帶Klotho基因的重組質粒。攜帶Klotho基因的重組質粒經包裝、擴增、純化、滴度測定均由上海閃晶分子生物科技有限公司完成。病毒半數組織細胞感染量(TCID50)法測定出病毒滴度為1.5×1010TU·mL-1。

1.2.2大鼠急性心肌梗死模型制備及處理 參考文獻[6]中結扎左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠急性心肌梗死模型：利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用生物機能實驗系統對大鼠進行檢測。氣管插管后連接小動物呼吸機，開胸后，利用撐胸器使胸腔中心臟充分暴露，利用8-0無創傷絲線合針于肺動脈圓錐和主動脈交界處以下約2 mm穿過左冠狀動脈前降支，并進行結扎，建模成功標志：以結扎線以下心肌顏色變蒼白、波動減縮、心電圖示ST段抬高明顯為結扎成功。假手術組僅將8-0無創傷絲線穿過左冠狀動脈前降支而不結扎。10 min后，Klotho轉染組取200 μL的攜帶Klotho基因的質粒，分別于左心室游離壁上、下、左、右四個部位進行局部注射，模型組和空白質粒組則分別將等量的生理鹽水和空白質粒按照Klotho轉染組的方法進行局部注射。常規胸腔滴注利多卡因以防止室性心動過速、心室顫動的發生，將胸腔積液吸盡后，斷開呼吸機，負壓逐層關胸。待大鼠蘇醒后，拔除氣管插管，同組同籠喂養。術后3 d連續腹腔注射青霉素以預防感染。術后存活大鼠51只，假手術組14只、模型組12只、Klotho轉染組13只和空白質粒組12只。

1.2.3大鼠心功能檢測 各組14 d后，稱重，利用腹腔注射戊巴比妥鈉的方法將大鼠麻醉后，利用超聲心動圖對大鼠心功能進行檢測，檢測指標包括左心室射血分數(LVEF)、左心室收縮末期內徑(LVDs)、左心室舒張末期內徑(LVDd)和短軸縮短率(FS)。

1.2.4各組大鼠心肌梗死面積檢測 各組大鼠完成心功能檢測后，處死，打開胸腔，取出心臟，用生理鹽水反復沖洗，將殘留血液洗凈，去除表面結締組織，放入-80 ℃冰箱凍存15 min，取出后沿心臟縱軸方向從心底向心尖對左心室切片，厚度約2 mm，置于新配置的TTC溶液中，避光恒溫染色30 min，取出后，PBS沖洗3次，用4%多聚甲醛固定30～40 min，自然光下拍照，梗死區呈灰白色。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各組大鼠心肌梗死面積占全部心肌面積比例進行分析。

1.2.5各組大鼠心肌組織病理學和纖維化檢測 取各組心尖部心肌組織，PBS洗滌后，用4%多聚甲醛過夜固定，石蠟包埋，切片，利用免疫組織化學染色試劑盒檢測心肌組織病理學變化，利用Masson三色染色試劑盒對間質膠原纖維染色，利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對間質纖維化面積占組織切片總面積的比值進行分析。

1.2.6利用實時熒光定量PCR檢測各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細胞裂解液，用總RNA提取試劑盒提取組織中總RNA，利用紫外分光光度計檢測總RNA純度，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。利用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄為模板單鏈cDNA，利用PCR試劑盒進行PCR。引物序列分別為：Klotho引物(104 bp)：上游：5′-GCTCTCAAA-GCCCACATACTG-3′，下游：5′-GCAGCATAACGATA-GAGGCC-3′；TGF-β1引物(146 bp)：上游：5′-GGATACCAACTATTGCTTCAGCTCC-3′，下游：5′-AGGCT-CCAAATATAGGGGCAGGGTC-3′；CTGF引物(232 bp)：上游：5′-GCAGCGGTGAGTCCTTCC-3′，下游：5′-AATGTGTCTTCCAGTCGGTAGG-3′；β-actin引物(205 bp)：上游： 5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游：5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。PCR反應條件：95 ℃ 1 min，92 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，74 ℃ 30 s，連續進行40次循環，每個樣品均設置3個平行反應復孔。用2-△△Ct法分析各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因相對表達量。

1.2.7利用Western blot法檢測各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達 取各組大鼠心尖部心肌組織，研磨后加入細胞裂解液，用總蛋白提取試劑盒對組織中總蛋白進行提取，用BCA總蛋白檢測試劑盒對獲得的總蛋白進行檢測。取20 μg總蛋白，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移至聚偏氟乙烯膜，用5%脫脂奶粉室溫下封閉60 min，將一抗Klotho兔多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β和CTGF 多克隆抗體(稀釋比例分別為1 ∶800、1 ∶1 200和1 ∶600)加入，過夜孵育，用TBST沖洗3次，加入二抗，37 ℃條件下孵育4 h，用TBST沖洗3次，加入辣根過氧化物酶底物，暗室下反應30 min。拍照，利用圖像分析軟件按半定量法對各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白相對表達量進行分析。

2 結果

2.1各組大鼠心功能比較與假手術組相比，模型組、Klotho轉染組和空白質粒組大鼠LVEF和FS均降低，而LVDs和LVDd均升高，均差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組和空白質粒組相比，Klotho轉染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，均差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.2各組大鼠心肌梗死面積比較TTC染色結果顯示，假手術組大鼠心肌梗死面積為0.00%，模型組和空白質粒組大鼠心肌梗死面積分別為(39.09±4.66)%和(36.07±3.25)%，兩組均高于Klotho轉染組的(24.49±4.30)%，均差異有統計學意義(F=44.195，P<0.001)，詳見圖1。

2.3各組大鼠心肌組織病理學和纖維化比較HE染色結果顯示，假手術組大鼠心肌組織結構完整，可見細胞核和細胞質，以及細胞間連接，纖維整齊排列；模型組和空白質粒組大鼠心肌組織結構不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現斷裂、間質水腫，有大量炎癥細胞浸潤；Klotho轉染組大鼠心肌病理學改變較模型組和空白質粒組減輕，詳見圖2。

Masson染色結果顯示，假手術組大鼠心肌細胞規整排列，散在分布有少量的藍色膠原纖維；模型組和空白質粒組大鼠心肌細胞排列雜亂，期間可見大量的藍色膠原纖維；Klotho轉染組大鼠纖維化改變較模型組和空白質粒組減輕，詳見圖3。假手術組間質纖維化面積為(4.75±0.35)%，模型組和空白質粒組間質纖維化面積均增加，分別為(38.82±2.38)%和(38.50±2.91)%，與模型組和空白質粒組相比，Klotho轉染組則減少，為(21.88±2.38)%，均差異有統計學意義(F=719.697，P<0.001)。

2.4各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達比較與假手術組相比，模型組、空白質粒組和Klotho轉染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對表達量均降低，而TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均升高，均差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組和空白質粒組相比，Klotho轉染組大鼠心肌組織中Klotho mRNA相對表達量升高，而TGF-β1、CTGF mRNA相對表達量均降低，均差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

2.5各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達比較與假手術組相比，模型組、空白質粒組和Klotho轉染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對表達量均降低，而TGF-β1、CTGF蛋白相對表達量均升高，均差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組和空白質粒組相比，Klotho轉染組大鼠心肌組織中Klotho蛋白相對表達量升高，而TGF-β1、CTGF蛋白相對表達量均降低，均差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3和圖4。

表1 各組大鼠心功能比較

注：與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質粒組相比，cP<0.05

表2 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF基因表達比較

注：與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質粒組相比，cP<0.05

表3 各組大鼠心肌組織中Klotho、TGF-β1和CTGF蛋白表達比較

注：與假手術組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與空白質粒組相比，cP<0.05

圖4 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中

3 討論

心肌梗死作為心內科常見的危急癥，發病率居高不下，且近年來呈逐年上升趨勢，是嚴重威脅人群生命健康的重要疾病[7]。Talman和Ruskoaho[8]研究表明，心肌纖維化所致心肌重構在心肌梗死中扮演重要角色。心肌纖維化是心肌中成纖維細胞被大量活化，細胞外基質大量產生，是多因素、多基因、多步驟共同作用的結果[9]。Klotho基因作為重要的抗衰老基因，參與了多種疾病的發生過程，在心血管疾病患者血漿中呈低表達[10]，且參與了心血管疾病的相關危險因素(如糖尿病、高血壓、血脂異常、腎功能異常等)的發生[11]。本研究進一步探討了Klotho基因在心肌梗死心肌纖維化中的作用，在利用腺病毒重組傳導Klotho基因對大鼠心肌處理后，PCR和Western blot檢測均顯示Klotho基因轉染組心肌組織中Klotho表達升高，提示轉染成功。

本研究采用結扎左冠狀動脈前降支的方法制備大鼠心肌梗死模型，HE染色結果顯示，模型組大鼠心肌組織結構出現不完整，纖維排列稀疏雜亂，肌纖維出現斷裂、間質水腫，有大量炎癥細胞浸潤；TTC染色結果顯示，模型組大鼠心肌梗死面積顯著增加，這些結果均提示成功構建了大鼠心肌梗死模型。在轉導了Klotho基因后，Klotho轉染組大鼠心肌病理學改變較模型組和空白質粒組減輕，且心肌梗死面積縮小，說明上調Klotho基因表達可有效減輕結扎左冠狀動脈前降支對心肌的損傷作用。心肌重構作為心肌梗死后重要的病理學改變，一方面可通過增加左心室心肌重量及室壁厚度而維持正常的心臟容積及LVEF，同時，隨著左心室的擴張，LVEF會隨之下降并表現出心力衰竭癥狀[12-13]。本研究顯示，與假手術組相比，心肌梗死大鼠均出現LVEF和FS降低，而LVDs和LVDd升高，提示心肌梗死導致的心肌重構可影響心臟功能。在轉導了Klotho基因后，與模型組和空白質粒組相比，Klotho轉染組大鼠LVEF和FS均升高，而LVDs和LVDd均降低，說明上調Klotho基因表達可有效改善大鼠心臟功能。

心肌纖維化作為心肌梗死后心力衰竭的重要病理基礎，是導致死亡的重要因素[14]，在此過程中，膠原蛋白會大量地堆積于細胞之間及血管間隙，使心肌活動力下降，心室壁僵硬、收縮及舒張功能受損，心功能不斷下降[15]。本研究Masson染色結果顯示，模型組和空白質粒組大鼠心肌細胞外堆積了大量藍染的纖維，間質纖維化面積顯著增加，這也是導致大鼠心功能下降的原因，但Klotho轉染組大鼠心肌組織Masson染色藍色區域顯著減少，間質纖維化面積減少，說明上調Klotho基因基因表達可有效減輕心肌纖維化。CTGF作為一種分泌性蛋白，在促進細胞外基質合成、加速纖維沉淀及抑制膠原降解中發揮重要作用，在心力衰竭后心肌纖維化進程中呈異常高表達[16]；TGF-β1是心肌纖維化過程中關鍵性調控因子，可促進CTGF的表達，二者在加速心肌重構及纖維化過程中發揮協同作用[17]。本研究顯示，模型組和空白質粒組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對表達量均升高，而Klotho轉染組大鼠心肌組織中TGF-β1、CTGF基因和蛋白相對表達量均降低，說明上調Klotho基因表達可能通過抑制TGF-β1、CTGF基因表達而阻斷急性心肌梗死大鼠心肌纖維化進程。

綜上所述，利用重組腺病毒載體傳導Klotho基因可有效改善心肌梗死大鼠心功能，減輕心肌纖維化，其機制可能與抑制TGF-β1、CTGF基因表達有關，有望為心肌梗死臨床治療提供新的靶點。

(本文圖1～3見插圖9-1)