高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定陳皮配方顆粒中3種成分的含量

李文東，梅雪，趙玉璽，魏瑩，李紅君，幸婷婷，劉福

(1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物研究所，四川 南充 637000)

中藥配方顆粒，是指以符合炮制規(guī)范的單味中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、精制而成的一種粉末或顆粒狀制劑[1]。它改變了傳統(tǒng)中成藥粗、大、黑形式，使傳統(tǒng)中藥湯劑擺脫了煎煮麻煩、攜帶不便、口服量大等缺點(diǎn)，使之轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N快捷、簡(jiǎn)單、方便、衛(wèi)生的劑型，是中藥湯劑的改革[2]。陳皮來(lái)源于蕓香科植物橘CitrusReticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮，具有理氣健脾，燥濕化痰的功效，用于治療胸脘脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等[3]。陳皮配方顆粒是以符合炮制規(guī)范的陳皮飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、濃縮、干燥、制粒而成的純中藥產(chǎn)品，其性味、歸經(jīng)、功效、成分與原中藥飲片基本一致，具有服用量小、攜帶保存方便、衛(wèi)生安全等特點(diǎn)。目前，對(duì)陳皮飲片質(zhì)量控制報(bào)道很多，包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別、含量測(cè)定等；但未見對(duì)陳皮配方顆粒含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。化學(xué)成分是中藥產(chǎn)生生物效應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，陳皮[4-6]中的主要活性成分橙皮苷[7]、川陳皮素[8]和橘皮素。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法同時(shí)測(cè)定其中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，為陳皮配方顆粒質(zhì)量的有效控制提供參考方法和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器十萬(wàn)分之一電子天平(Mettle AE 240)；Agilent-1260型高效液相色譜儀，包括：四元泵，在線脫氣機(jī)，紫外檢測(cè)器等；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，500 W，40 kHz)。

1.2試藥中藥配方顆粒陳皮(0.5 g相當(dāng)于飲片6 g；四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司；批號(hào)：1604027、1603026、1609028)；橙皮苷、川陳皮素和橘皮素(自制，1H-NMR和13C-NMR、ESI-MS鑒定，含量采用HPLC峰面積歸一化法計(jì)算不低于98%)；乙腈(HPLC級(jí)，賽默飛世爾科技，批號(hào)152833)；水為純水(Millipore水純化儀自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱取減壓干燥至恒重的對(duì)照品橙皮苷、川陳皮素和橘皮素適量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得含橙皮苷、川陳皮素和橘皮素232.00、15.56、15.40 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備取陳皮配方顆粒約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲(500 W，40 kHz)提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液作供試品溶液，即得。

2.3色譜條件色譜柱為Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，二元梯度洗脫：0～6 min，15%A→20%A；6～16 min，20%A→34%A；16～20 min，34% A→52%A；20～28 min，52% A；28～30 min，52%A→100%A；30～32 min，100%A→15%A，流速:1.0 mL·min-1，波長(zhǎng)切換(0～16 min，在283 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)橙皮苷；16～32 min，在330 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)川陳皮素和橘皮素)，柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.4定量限和檢測(cè)限因樣品中川陳皮素和橘皮素兩個(gè)成分的含量較低，故對(duì)其最低定量限和檢測(cè)限進(jìn)行考察，按上述色譜條件用對(duì)照品溶液稀釋，結(jié)果當(dāng)S/N=10時(shí)，川陳皮素和橘皮素的定量限分別為：8.46、10.13 ng；當(dāng)S/N=3時(shí)，檢測(cè)限分別為2.36、3.04 ng。

2.5線性關(guān)系考察分別精密稱取對(duì)照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得含橙皮苷、川陳皮素和橘皮素120.18、9.883、4.72 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。分別進(jìn)樣1、4、8、10、16、20 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以對(duì)照品的量(ng)為橫坐標(biāo)(X)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。其線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)(n=6)結(jié)果見表1。

注：A為混合對(duì)照品溶液；B為供試品溶液；1為橙皮苷；2為川陳皮素；3為橘皮素

圖1 HPLC色譜圖

2.6精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品(橙皮苷、川陳皮素和橘皮素232、15.56、15.4 mg·L-1)溶液10 μL，在上述相同色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的峰面積的RSD值分別為2.2%、1.9%、1.7%，結(jié)果表明精密度良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)稱取陳皮配方顆粒(批號(hào)1604027)共5份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果橙皮苷的平均含量為1.182%，RSD為1.03%；川陳皮素的平均含量為0.072%，RSD為1.29%；橘皮素的平均含量為0.013%，RSD為1.61%；表明重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)取陳皮配方顆粒約0.5 g，精密稱定，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0、2、4、6、8、10、12 h注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測(cè)定峰面積，橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的峰面積的RSD分別為1.2%、1.1%、1.9%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密稱取已測(cè)含量(橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量分別為1.182%、0.071 8%、0.013 1%)陳皮配方顆粒(批號(hào)1604027)的樣品共6份，每份約0.25 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液(橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的濃度分別為2.955、0.179 5、0.032 75 g·L-1)1 mL，按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量及加樣回收率，結(jié)果為見表2。

2.10樣品含量測(cè)定精密稱取3批樣品各0.5 g，分別按“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)下色譜條測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果/(%,n=3)

3 討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇取橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的對(duì)照品溶液置UV-1750紫外可見分光光度計(jì)下，于200～700 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果橙皮苷在283 nm處有最大吸收，川陳皮素和橘皮素綜合考慮在330 nm有較大吸收。結(jié)合色譜圖，將波長(zhǎng)設(shè)定為0～16 min時(shí)283 nm，16～ 32 min時(shí) 330 nm。

3.2色譜條件的選擇樣品中待分離的3個(gè)成分極性不同，等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離，故采用梯度洗脫的方法。根據(jù)參考文獻(xiàn)[9-10]，試驗(yàn)考察了多種流動(dòng)相系統(tǒng)(甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%醋酸水、乙腈-0.1%醋酸水)結(jié)果顯示，乙腈-1%醋酸水能達(dá)到分離度的要求，分離時(shí)間合適，最后確定流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，二元梯度洗脫：0～6 min，15%A→20%A；6～16 min，20%A→34%A；16～20 min，34%A→52%A；20～28 min，52% A；28～30 min，52%A→100%A；30～32 min，100%A→15%A。

3.3提取條件的選擇本試驗(yàn)考察了超聲提取法和水浴加熱回流法不同提取時(shí)間(0.5、1、1.5 h)的提取效果，結(jié)果表明，超聲提取和水浴加熱回流提取0.5 h(提取回收率在90%左右，且提取不完全)；兩法提取1、1.5 h，提取回收率均在98%。超聲提取操作簡(jiǎn)便，故本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取的方法提取1 h。

3.4含量測(cè)定通過(guò)對(duì)川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院不同批次樣品中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明，同一廠家不同批次陳皮配方顆粒3個(gè)成分的含量基本相同。2015版《中國(guó)藥典》的規(guī)定，陳皮飲片中橙皮苷的含量不得低于3%；現(xiàn)檢測(cè)出陳皮配方顆粒中橙皮苷的含量為1.2%左右。可以為陳皮配方顆粒質(zhì)量的有效控制提供參考。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

4 小結(jié)

陳皮配方顆粒失去原飲片的形態(tài)特征(如，外表面的顏色及油室、內(nèi)表面顏色，飲片質(zhì)地等)，同時(shí)也損失其顯微鑒別的特征(細(xì)胞、結(jié)晶的形態(tài)等)。因此，制定科學(xué)有效的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制產(chǎn)品質(zhì)量，成為配方顆粒安全有效的關(guān)鍵所在。本試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定陳皮配方顆粒中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量，方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠和重復(fù)性好，可快速準(zhǔn)確測(cè)定陳皮配方顆粒中橙皮苷、川陳皮素和橘皮素的含量。