腫瘤浸潤(rùn)性樹突狀細(xì)胞和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及意義

楊會(huì)杰，任少達(dá)，郭瑞娜， 魏民，李修順，李鴻超，李瑩

(1.濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院病理科，河南 濮陽(yáng) 457001；2.聊城市人民醫(yī)院呼吸科，山東 聊城 252002)

肺癌早期可經(jīng)血液、淋巴結(jié)、直接擴(kuò)散等方式轉(zhuǎn)移，腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要危險(xiǎn)因素[1-2]。據(jù)報(bào)道僅2012年全球范圍就有1 820 000新發(fā)的肺癌患者，其中1 590 000例死亡，肺癌患者5年生存率僅有2%～30%[3]。最常見的肺癌類型為非小細(xì)胞肺癌，與小細(xì)胞肺癌相比，其分裂和擴(kuò)散較慢，但由于確診時(shí)患者往往處于中晚期，因此5年生存率非常低[4-5]。目前研究已證實(shí)肺癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與免疫抑制有關(guān)[6-7]。Li等[8]研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌有關(guān)，其水平升高可能與免疫的耐受有關(guān)，降低其水平或許可改善非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后。樹突狀細(xì)胞是機(jī)體的一種抗原呈遞細(xì)胞，其功能最大，在腫瘤患者中，主要將腫瘤細(xì)胞表面分子標(biāo)志物和代謝產(chǎn)物等呈遞給細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[9-10]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)同樣可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。然而目前關(guān)于腫瘤浸潤(rùn)性樹突狀細(xì)胞(tumor infiltrating dendritic cells，TIDC)和VEGF在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平尚不清楚。本研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌組織和健康組織中TIDC和VEGF表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討其與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料自2014年1月至2016年12月，連續(xù)性收集濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者106例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)非小細(xì)胞肺癌(均有病理確診)；(2)行手術(shù)切除可以獲得腫瘤標(biāo)本；(3)年齡18～75歲；(4)同意參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他惡性腫瘤；(2)肺癌復(fù)發(fā)；(3)小細(xì)胞肺癌；(4)術(shù)前曾接受放療、化療或分子生物治療；(5)6個(gè)月內(nèi)曾接受免疫調(diào)節(jié)劑；(6)潰瘍性結(jié)腸炎等免疫系統(tǒng)疾病；(7)急性或慢性感染期；(8)肝腎等臟器功能不全；(9)既往心肌梗死、腦出血等重大心血管疾病。所有患者對(duì)本研究均知情同意并簽署知情同意書，本研究通過濮陽(yáng)市油田總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法入院后完善相關(guān)檢驗(yàn)檢查，擇期行“肺癌切除術(shù)”，術(shù)中取腫瘤組織，檢測(cè)腫瘤組織中(據(jù)腫瘤邊緣1 cm以上的腫瘤組織)和周圍健康組織中TIDC(距腫瘤邊緣3 cm以上的正常組織)和VEGF水平。并收集患者性別、年齡、臨床TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、病理類型等臨床特征，分析TIDC和VEGF與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的相關(guān)性。

1.3檢測(cè)方法

1.3.1VEGF和TIDC檢測(cè)方法 均為免疫組織化學(xué)染色，其中TIDC采用S-100兔抗人多克隆抗體標(biāo)記，VEGF采用VEGF兔抗人多克隆抗體標(biāo)記(試劑均購(gòu)買自北京中杉生物技術(shù)有限公司)，采用SABC法檢測(cè)，具體操作步驟見說(shuō)明書。結(jié)果判讀(1)TIDC：行免疫組織化學(xué)染色，400倍鏡下對(duì)TIDC細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)抽取5個(gè)視野，其均值作為該患者的TIDC數(shù)密度；(2)染色結(jié)果為淡黃色或棕黃色為VEGF陽(yáng)性，否則為陰性。本研究中非小細(xì)胞肺癌組織中TIDC和VEGF表達(dá)圖片資料見圖1。

1.3.2TIDC細(xì)胞的MHC-Ⅱ和CD54表型測(cè)定 取檢測(cè)的組織脫蠟、水化后，使用胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，過濾后離心(800 r·min-1)，去除細(xì)胞碎片，沉淀細(xì)胞PBS重懸，取106個(gè)細(xì)胞，離心后去掉上清液，分別加入MHC-Ⅱ和CD54APC抗體(試劑均購(gòu)買自北京中杉生物技術(shù)有限公司)，加入固定液進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)(BD FACSAriaⅡ分選型流式細(xì)胞儀)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件完成數(shù)據(jù)分析。兩組患者TIDC數(shù)密度等計(jì)量資料之間差異采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；兩組患者VEGF陽(yáng)性率差異采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中和健康組織TIDC和VEGF表達(dá)比較與健康組織比較，腫瘤組織中TIDC數(shù)密度顯著降低[(10.58±3.18)比(18.93±3.26)，P=0.000]；VEGF陽(yáng)性率顯著增高(43.45%比11.32%，P=0.000)；MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC顯著降低[(6.48±1.04)%比(12.57±2.57)%，P=0.000]；CD54陽(yáng)性DC顯著降低[(7.12±1.59)比(12.81±2.81) %，P=0.000]。見表1。

2.2非小細(xì)胞肺癌患者年齡與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系年齡≥65歲的患者與其他患者相比，TIDC數(shù)密度、VEGF陽(yáng)性率、MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC和CD54陽(yáng)性DC比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3非小細(xì)胞肺癌患者性別與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系男性與女性患者TIDC數(shù)密度、VEGF陽(yáng)性率、MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC和CD54陽(yáng)性DC比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4非小細(xì)胞肺癌患者臨床TNM分期與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系與TNM分期為Ⅰ或Ⅱ期的患者相比，Ⅲ或Ⅳ期患者TIDC數(shù)密度顯著降低[(9.51±2.88)比(11.82±3.58)，P=0.000]；VEGF陽(yáng)性率顯著增加(61.40%比20.41%，P=0.000)；MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC顯著降低[(7.83±1.05)%比(5.32±0.91) %，P=0.000]；CD54陽(yáng)性DC顯著降低[(6.26±1.01)%比(8.12±1.72)%，P=0.000]。見表4。

2.5非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞分化程度與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系與腫瘤細(xì)胞為高分化的患者相比，中低分化的患者TIDC數(shù)密度顯著降低[(9.58±2.58)比(12.37±3.13)，P=0.000]；MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC顯著降低[(6.01±1.09)%比(7.32±0.93)%，P=0.000)；CD54陽(yáng)性DC顯著降低[(6.66±1.68)%比(7.94±1.58)%，P=0.000]。見表5。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中和VEGF表達(dá)比較

表2 非小細(xì)胞肺癌患者年齡與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系

表3 非小細(xì)胞肺癌患者性別與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系

表4 非小細(xì)胞肺癌患者臨床TNM分期與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系

表5 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞分化程度與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系

表6 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤病理類型與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系

2.6非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤病理類型與腫瘤組織中TIDC和VEGF關(guān)系腺癌與鱗癌患者TIDC數(shù)密度、VEGF陽(yáng)性率、MHC-Ⅱ陽(yáng)性DC和CD54陽(yáng)性DC比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌的主要類型，是導(dǎo)致中老年患者死亡的重要原因之一[11]。肺癌的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫相關(guān)，近些年腫瘤免疫學(xué)的發(fā)展為腫瘤的治療提供了新方向。樹突狀細(xì)胞在腫瘤患者可以作為一種抗原呈遞細(xì)胞，刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞等的增殖，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷。而DC細(xì)胞在特定環(huán)境下可以表現(xiàn)為免疫抑制作用，這部分DC細(xì)胞是不成熟或分化異常的DC細(xì)胞組成，主要表現(xiàn)為MHC-Ⅱ和CD54陽(yáng)性率低下[12-14]。然而目前關(guān)于DC細(xì)胞及其表型在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)尚不清楚。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了本研究，結(jié)果顯示腫瘤組織中TIDC數(shù)密度、CD54陽(yáng)性和MHC-Ⅱ陽(yáng)性率均顯著低于正常組織(P<0.05)，表明非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中DC細(xì)胞低表達(dá)，且以不成熟的DC細(xì)胞為主，由于DC細(xì)胞是人體最強(qiáng)大的抗原呈遞細(xì)胞，腫瘤環(huán)境中DC水平的降低，可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞的增生促進(jìn)作用下降，最終導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用降低[15-16]。另外，不成熟或分化異常的DC細(xì)胞，具有免疫抑制作用，可以分泌不同的細(xì)胞因子促進(jìn)T細(xì)胞免疫由Th1免疫向Th2免疫漂移，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對(duì)機(jī)體的免疫耐受[17-18]。因此腫瘤組織中DC細(xì)胞數(shù)量降低與不成熟或異常分化，可能會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不良，可惜目前相關(guān)研究缺乏。本研究顯示TNM分期為Ⅲ或Ⅳ期、腫瘤細(xì)胞分化程度為低分化的患者腫瘤組織中TIDC數(shù)密度、CD54陽(yáng)性和MHC-Ⅱ陽(yáng)性率也同樣低于其余非小細(xì)胞肺癌患者(P<0.05)。DC細(xì)胞療法可能有助于改善非小細(xì)胞肺癌患者臨床預(yù)后。Zhou等[19]研究顯示化療聯(lián)合DC細(xì)胞可以增強(qiáng)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。Liu等[20]研究則顯示鈣網(wǎng)織蛋白可以通過促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟和增殖，進(jìn)而促進(jìn)抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞對(duì)非小細(xì)胞肺癌的殺傷作用。Zhu等[21]研究則顯示DC聯(lián)合放療可以明顯改善ⅢB期非小細(xì)胞肺癌患者的臨床治療有效率。但是目前相關(guān)研究較為缺乏，尚不能作為依據(jù)指導(dǎo)臨床治療，急需大樣本量的多中心隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)。另外，本研究顯示非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤組織中VEGF陽(yáng)性率增高，且TNM分期為Ⅲ或Ⅳ期的患者VEGF陽(yáng)性率高于Ⅰ或Ⅱ期患者(P<0.05)，VEGF是腫瘤血管生成的重要促成因子，腫瘤組織中VEGF高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[22-24]。

綜上所述，TIDC在腫瘤組織中低表達(dá)，且多為不成熟的調(diào)節(jié)性DC細(xì)胞，VEGF在腫瘤組織中高表達(dá)，均與患者臨床預(yù)后惡化有關(guān)。

(本文圖1見插圖9-2)