程序性細胞死亡受體1配體在彌漫大B細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

梁莉，夏瑞祥，葛健

(安徽醫科大學第一附屬醫院血液內科，安徽 合肥 230022)

彌漫大B細胞淋巴瘤(DLBCL)是成人非霍奇淋巴瘤中的主要類型，約占30%～40%，多見于中老年人，在中國以40～50歲患者居多。在近年治療方法的進步下，一些患者預后良好，但仍有部分患者因疾病復發或者耐藥面臨治療效果差[1]，研究影響其臨床特征及預后的因素，為新的治療方案提供思路。

程序性死亡受體1配體(PD-L1)為B7家族中的一員，是一種跨膜蛋白。正常情形下免疫系統會對聚集在淋巴結或脾臟的外來抗原產生反應，促進具有抗原特異性的T細胞增生。而程序性死亡受體1(PD-1)及PD-L1結合后能產生抑制性信號，減少T細胞的產生,這一機制在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中發揮重要作用。多種腫瘤細胞表面也表達 PD-L1，在腫瘤細胞中表達的PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞表面的PD-1分子結合，抑制淋巴細胞功能和細胞因子釋放，誘導淋巴細胞凋亡，從而抵抗淋巴細胞殺傷，最終導致腫瘤發生免疫逃逸。與PD-L1結合的受體PD-1，在機制中也起著必不可少的作用，PD-1抗體已成為首款依照生物標志物進行癌癥治療的新藥，用于治療轉移性黑色素瘤，轉移性非小細胞肺癌，復發性及轉移性頭頸癌，難治性經典霍奇金淋巴瘤或是尿路上皮癌的特定患者。近些年研究已經證實PD-L1在多種腫瘤細胞和腫瘤組織中均有表達[2-3]，對于PD-L1在DLBCL的表達相關研究仍需進一步進行，故本研究回顧性分析安徽醫科大學第一附屬醫院80例DLBCL的患者病理組織中PD-L1的表達，并分析統計該些患者的年齡分期分組及療效，探討其相關性，為DLBCL患者的危險分層提供新的方向，為下一步治療提供相關實驗依據。

1 資料與方法

1.1一般資料收集安徽醫科大學第一附屬醫院2012年2月至2015年6月期間于病理科經組織形態學及免疫組織化學新診斷為DLBCL患者的甲醛固定石蠟包埋的病理組織標本，診斷標準參照2008年WHO血液淋巴腫瘤分類標準[4]。要求：標本獲得于新診斷且未接受任何化療時，并且保證患者臨床病例及預后資料完整,對于合并活動性乙型肝炎病毒(HBV)感染及其他腫瘤的患者排除。本研究獲安徽醫科大學第一附院醫院倫理委員會批準，患者或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2試劑和儀器兔抗人PD-L1抗體(一抗)，Abcam公司；PV-6000聚合物免疫組織化學檢測試劑盒(酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；濃縮型DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；PBS緩沖液，購自無錫傲銳東源生物科技有限公司； 檸檬酸購自無錫傲銳東源生物科技有限公司；梯度酒精；二甲苯；蘇木素；中性樹膠封固劑； 組織防脫載玻片。

1.3實驗方法根據選好的病理組織蠟塊，由病理科老師切片及攤片，切片標注對應的病理號。實驗步驟如下：(1)烤片-脫蠟-水化-抗原修復-畫圈-孵育-吐溫；(2)滴加一抗(PD-L1)：根據組織大小自行調整滴加量，4 ℃溫度下過夜孵育；(3)滴加二抗，室溫下孵育30 min，再經PBS沖洗及DAB顯色處理；(4)復染-藍化-置于梯度濃度酒精及二甲苯中；(5)封片：滴加中性樹膠封固劑，放置于封片機。

1.4結果判讀對染色成功的切片，由2位資深病理科醫師在未知患者信息的情況下進行獨立讀片，對于結果不一致的切片由第3位病理科醫師復核，經討論后獲得一致結果,根據讀片結果，PD-L1在細胞膜上表達，本實驗PD-L1表達陽性的標準為PD-L1陽性細胞占所有細胞>30%，陽性標準基于既往研究的陽性標準[5-6]，以便于橫向對比。

1.5臨床資料收集所有患者按Ann Arbor-Cotswolds分期，ECOG評分，IPI評分系統對患者進一步分期的評分，診斷后經過至少3個療程CHOP(環磷酰胺、表柔比星、長春地辛及地塞米松)或RCHOP(CHOP方案聯合利妥昔單抗)方案進行化療，80例患者的平均中位評估時間為7個療程，均在一線CHOP或R-CHOP方案化療后進行評估，根據《2016年NCCN淋巴瘤治療指南》進行療效評估。

1.6統計學方法采用SPSS 23.0軟件進行統計學處理，數據比較采用Pearson χ2檢驗分析PD-L1表達與患者臨床特征的關系，不滿足χ2檢驗條件時應用Fisher精確概率法。應用單因素和多因素logistic分析方法影響患者療效的因素。采用多元逐步法回歸分析(α剔除>0.1，α進入<0.05)。

2 結果

2.1患者臨床及病理特征本研究納入了80例DLBCL患者，其中男性49例(61%)，女性31例(39%)，發病年齡16～82歲，中位年齡58歲，年齡≥60歲者有29例(36%)，患者PD-L1的表達與治療效果相關，PD-L1陽性的患者的緩解率為58%，顯著低于PD-L1陰性患者的緩解率(90%)，差異有統計學意義(P=0.001)，PD-L1陽性與non-GCB亞型相關，non-GCB亞型患者PD-L1陽性率為71%，而GCB亞型為29%(P=0.035)，PD-L1的表達與患者的年齡、分期、IPI評分、B組癥狀的有無、ECOG評分、LDH升高、>1處結外受累無相關性。結果見表1。

2.2影響患者療效的單因素分析結果顯示年齡(OR=0.353，P=0.058)，分期(OR=0.126，P=0.002)、IPI評分(OR=0.123，P=0.001)、結外受累>1(OR=0.180，P=0.006)、加用利妥昔單抗(OR=4.257，P=0.015)，PD-L1(OR=0.157，P=0.002)，DCBCL類型是影響療效的因素。

表1 PD-L1表達與患者臨床資料列聯表

2.3影響患者療效的多因素分析采用P<0.1的變量進入多因素分析，因IPI評分包含年齡分期結外受累等因素，納入PD-L1，IPI評分，DCBCL類型及加用利妥昔單抗四個因素，最終僅PD-L1陽性差異有統計學意義(P=0.006)。結果見表2。

3 討論

近年來，隨著大家對腫瘤微環境認識的提高，腫瘤免疫療法興起，PD-L1與PD-1作為重要的免疫負調控分子，尤受到大家的廣泛關注。PD-L1/PD-1通路抑制T細胞的功能，使其喪失對腫瘤細胞的殺傷作用，降低IFN-γ、IL-2和IL-10的分泌，而由于CD4+T細胞的自分泌作用，此途徑對CD8+T細胞的抑制作用更加顯著[7]。腫瘤細胞通過此途徑逃逸CTL的殺傷作用，減弱集體對腫瘤細胞的免疫應答，進而進一步影響患者療效及預后。Muenst等[8]的試驗中表明，乳腺癌患者病理組織中PD-L1的表達與年齡腫瘤大小，腫瘤分類，淋巴結狀態，ER表達缺失等密切相關，在多元分析中，PD-L1表達仍是一個獨立的不良預后因子。我們推斷阻止此通路中兩者的任一均可恢復宿主對腫瘤的免疫，目前已有試驗表明在部分黑色素瘤，肺癌腎癌及膀胱癌患者中，阻斷此通路取得了較好的療效，能夠顯著延長患者的總生存期，副作用相對化療藥物較小。如應用PD-1抗體治療非細胞肺癌患者，約20%～25%的患者獲得客觀緩解[9]。目前針對PD-L1/PD-1，FAD已批準數個單克隆抗體上市。確定哪些患者可以從免疫治療中獲益仍是一個重要的臨床問題。

表2影響患者療效的單因素與多因素logistic回歸分析

項目單因素分析OR(95%CI)值P值多因素分析OR(95%CI)值P值年齡≥60歲0.353(0.121～1.036)0.058Ann Arbor分期0.126(0.033～0.483)0.002IPI評分0.123(0.038～0.401)0.001B組癥狀0.512(0.177～1.483)0.217體能評分>1分0.240(0.076～0.759)0.015LDH升高0.597(0.205～1.740)0.344結外受累>1處0.180(0.053～0.613)0.006PD-L1陽性0.157(0.049～0.506)0.0020.171(0.049～0.602)0.006DCBCL類型5.333(1.402～20.285)0.014加用利妥昔單抗4.257 (1.763～9.654)0.015

對于淋巴瘤患者，很多學者做了類似的試驗，由于PD-L1在腫瘤組織中的表達的異質性，經典型霍奇金淋巴瘤及外周T細胞淋巴瘤常有PD-L1的高表達，而濾泡細胞淋巴瘤及Burkitt淋巴瘤PD-L1相對低表達。PD-L1的高表達對淋巴瘤患者臨床特征及預后的影響也有相關文獻報導，Paydas等[10]分析了87例HL患者石蠟病理組織中PD-L1的表達，表達陽性及陰性的患者OS及DFS差異明顯，且差異具有統計學意義。在韓麗娟等[11]的研究表明，NK/T細胞淋巴瘤組織中PD-L1的表達水平與臨床分期，LDH表達呈正相關，與臨床療效，IPI評分呈負相關。而對于彌漫大B細胞淋巴瘤的患者，有一項研究報道[6]PD-L1陽性患者占33%(以PD-L1陽性細胞/所有細胞>30%為陽性標準)，PD-L1陽性與低CR率相關，PFS和OS低于PD-L1陰性患者。另一項研究[5]以PD-L1陽性細胞/所有細胞>20%為陽性標準，腫瘤微環境中PD-L1陽性表達的患者占15.3%，在多元分析后PD-L1陽性仍為獨立的預后因子。本實驗中PD-L1陽性的患者占所有患者的35.0%，結論與既往報導相仿。試驗中所應用的免疫組織化學法是檢測PD-L1在腫瘤組織中表達的主要方法，但仍有許多因素干擾，包括試驗抗體的選取，操作步驟及讀片，均增加了試驗的難度。這也導致試驗中的數據難以做到統一。

本實驗結果表明，腫瘤病理組織中PD-L1的陽性水平與臨床分期，IPI評分，LDH升高等臨床特征無關，與療效CR率呈負相關，表明PD-L1/PD-1通路對DLBCL患者疾病的發展及治療有重要作用。因不同病理類型淋巴瘤PD-L1的表達存在異質性，仍需不斷完善相關研究。但不同試驗均表明，PD-L1是部分類別淋巴瘤患者預后的危險因素，這可能作為部分淋巴瘤危險分層指標和潛在治療靶點。在彌漫大B細胞淋巴瘤中，有試驗表明應用PD-1抗體治療總反應率為近二分之一[12]。對于PD-1及PD-L1均陽性表達的病人，根據PD-1/PD-L1通路作用機制，PD-1抗體或者PD-L1抗體均可阻斷通路并促進免疫恢復，PD-1抗體治療有效已有實驗驗證，那么根據本實驗初步推斷PD-L1抗體也可提高患者治療有效率，因此PD-L1抗體能否進一步完善將會是我們關注的熱點，我們期待抗體應用范圍逐漸擴大，為腫瘤患者帶來更多的希望。