苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠的改善作用及其機(jī)制?

鄒亞興，吳文宇，羅 莉△，龍奉璽，郭 斌，陳 杰，王 倩，陳志平

(1.貴州省沿河土家族自治縣看守所醫(yī)務(wù)室，貴州 沿河 565300；2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，貴陽(yáng) 550001；3.貴航貴陽(yáng)醫(yī)院，貴陽(yáng) 550009；4.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550002)

惡性腫瘤和心血管疾病(CVD)已成為中國(guó)人的主要死亡原因之一[1]，70%以上的老年腫瘤患者合并有心血管基礎(chǔ)疾病[2]。因?yàn)榭鼓[瘤化療藥物普遍具有心血管毒性，降低了合并有心血管疾病患者對(duì)化療的耐受性，提高了化療風(fēng)險(xiǎn)。多柔比星是臨床常用的蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，由于其可能導(dǎo)致充血性心力衰竭的副作用，極大地限制了其臨床使用[3]。雖然嚴(yán)格控制多柔比星的使用量(低于550 mg/m2)可以顯著降低其導(dǎo)致心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，但對(duì)于合并心血管疾病的患者來(lái)說(shuō)，其藥物性心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)仍然很大。因此，在多柔比星治療期間，保護(hù)心肌功能、降低心臟毒性、控制心力衰竭是必不可少的。筆者臨床運(yùn)用經(jīng)方苓桂術(shù)甘湯配伍黃芪、丹參治療化療藥物所致心力衰竭收到良好療效。因此，本研究致力于探討苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雄性大鼠30只，體質(zhì)量(182±11.6) g，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心(許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018)，飼養(yǎng)于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)環(huán)境25～30℃，相對(duì)濕度40%～45%，籠養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)鼠食，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始造模。

1.1.2 試劑與儀器 苓桂術(shù)甘湯組成：茯苓12 g，桂枝9 g，白術(shù)6 g，甘草6 g，黃芪15 g，丹參10 g。中藥飲片均購(gòu)于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥房，水煮醇沉濃縮法制成濃度為2 g/mL的濃縮液冷藏備用。注射用鹽酸多柔比星(DOX)，海正輝瑞(批號(hào)15008511)；大鼠三磷酸腺苷(ATP)、大鼠一磷酸腺苷(AMP)、大鼠游離脂肪酸(FFA)酶聯(lián)免疫分析ELISA測(cè)試盒，R&D，美國(guó)；AMPKα、p-AMPKα(Thr172)抗體，CST，美國(guó)；超聲診斷系統(tǒng)，加拿大Vevo 770；MP-150型多道生理記錄儀，普升科技有限公司；SZ-40體視顯微鏡，Olympus，日本；RM2255全自動(dòng)切片機(jī)，LEICA，德國(guó)；電泳儀，北京六一儀器廠；蛋白質(zhì)電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，Bio-Rad，美國(guó)；倒置顯微鏡，Olympus，日本；酶標(biāo)儀，Bio-Rad，美國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 多柔比星所致心力衰竭模型參考文獻(xiàn)制備[4],腹腔注射多柔比星2.5 mg/kg，每周3次，連續(xù)2周共6次，總劑量15 mg/kg。經(jīng)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)左室射血分?jǐn)?shù)較基線減少10%者為造模成功。

1.2.2 分組及處理 30只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、模型組和苓桂術(shù)甘湯治療組3組各10只。對(duì)照組腹腔注射0.9%生理鹽水2.5 mg/kg，每周3次，連續(xù)2周共6次，其余組按心力衰竭模型制備。治療組給予苓桂術(shù)甘湯(0.2 g/ml)灌胃治療，每日1次共2周。對(duì)照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每日1次共2周。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)

(1)超聲心動(dòng)圖檢測(cè)：所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前及2周、4周各做1次超聲心動(dòng)圖評(píng)價(jià)心臟功能。實(shí)驗(yàn)大鼠胸前剃毛，經(jīng)1.5%～2.0%異氟烷麻醉并固定四肢。采用加拿大Vevo 770 (Visual Sonics Inc, Toronto, ON, Canada)17.5 MHz高頻率探頭(model 716)進(jìn)行超聲檢查[5]。測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張期后壁厚度(LVPWd)、左室收縮期后壁厚度(LVPWs)、左室射血分?jǐn)?shù) (%EF)和左室短軸縮短率(%FS)。

(2)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)：常規(guī)麻醉、固定，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈行左心室插管，多道生理記錄儀記錄左室收縮壓(left ventricle systolic pressure，LVSP)、左室舒張末期壓力(left ventricle end-disatolic pressure，LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速和下降速率(±dp/dtmax)。

(3)全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)測(cè)定：實(shí)驗(yàn)大鼠在檢測(cè)前用電子天平稱體質(zhì)量(BW)。實(shí)驗(yàn)完畢后開(kāi)胸取出心臟，用生理鹽水將血洗凈，用吸紙吸去水分，用天平稱取全心質(zhì)量(HW)，并計(jì)算出全心質(zhì)量指數(shù)(HW/BW)。

(4)病理切片制作與染色：心臟組織4%多聚甲醛固定24 h后，依次濃度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片與烤片，常規(guī)蘇木精HE染色，電子顯微攝像機(jī)拍照。

(5)ELISA法檢測(cè)心肌組織中ATP、AMP、FFA蛋白水平：分別取各組心肌組織100 mg在冰上剪碎，超聲裂解，4 ℃ 13500 rpm離心30 min，取上清按ELISA試劑盒測(cè)定ATP、AMP、FFA蛋白含量。

(6)Western blot法檢測(cè)心肌組織中AMPK-α、p-AMPK-α蛋白含量：取液氮凍存的心肌組織，用RIPA裂解液提取蛋白后，BCA法蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，濕法將電泳所得膠上的蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用37 ℃封閉2 h勿洗，加一抗(AMPK-α為1∶1000，p-AMPK-α為1∶200)4 ℃下孵育過(guò)夜；TBST溶液洗滌3次，每次10 min；加山羊抗兔二抗(AMPK-α為1∶5000，AMPK-α為1∶2000)，室溫下?lián)u床搖擺1 h；TBST溶液洗滌3次，每次10 min；ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色曝光，用Quantity One分析AMPK-α、p-AMPK-α和內(nèi)參β-actin的灰度值[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠心功能的影響

表1顯示，模型組大鼠與對(duì)照組比較，%EF和%FS 明顯下降，心衰明顯，LVIDs顯著增大，LVPWd和LVPWs顯著變薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另一方面，苓桂術(shù)甘湯治療組和模型組比較，可顯著改善LVIDs增大、LVPWd及LVPWs變薄的情況，同時(shí)%EF和%FS顯著回升，心臟功能得到恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠心功能影響比較(例，

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

表2顯示，模型組大鼠與對(duì)照組比較，LVSP和+dp/dtmax明顯下降，而LVEDP和-dp/dtmax明顯升高(P<0.05)，LVEDP值無(wú)明顯變化，表明模型大鼠左心室泵血能力下降。治療組對(duì)各指標(biāo)均有不同程度的改善作用，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響(例，

注：與對(duì)照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠HW/BW比值及心肌能量代謝的影響

表3顯示，模型組大鼠與對(duì)照組比較，BW明顯下降，HW/BW比值明顯增加，ATP含量顯著降低，AMP、FFA含量及AMP/ATP比值明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，苓桂術(shù)甘湯治療組BW回升，HW/BW比值降低，且治療組大鼠心肌組織ATP含量明顯上升，AMP、FFA含量及AMP/ATP比值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠HW/BW比值及心肌能量代謝的影響(例，

注：與對(duì)照組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05

2.4 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠對(duì)心肌組織的影響

圖1顯示，模型組與對(duì)照組比較，心臟左室內(nèi)徑明顯增大，左室后壁變薄，纖維稀疏。苓桂術(shù)甘湯治療組心臟左室內(nèi)徑及左室后壁較模型組有改善效果。從圖2可以看出，對(duì)照組心肌細(xì)胞正常，無(wú)空泡變性、壞死、水腫，細(xì)胞質(zhì)豐富均勻，細(xì)胞間隙正常，肌纖維無(wú)肥大、排列整齊，無(wú)肌纖維斷裂。模型組可見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大，心肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)有空泡形成、間質(zhì)水腫、心肌細(xì)胞間隙增寬、心肌纖維斷裂和肌原纖維溶解。苓桂術(shù)甘湯治療組少見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大、空泡及水腫，心肌細(xì)胞間隙略寬，少見(jiàn)心肌纖維斷裂。

圖1 大鼠心臟大體病理切片 HE 染色結(jié)果(HE ×1.2)

圖2 大鼠心肌病理切片 HE 染色結(jié)果(HE × 200)

圖3 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠p-AMPKα/AMPKα的影響注：與對(duì)照組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05

2.5 苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致心力衰竭大鼠p-AMPKα/AMPKα的影響

圖3顯示，模型組大鼠與對(duì)照組比較，大鼠心肌組織p-AMPKα蛋白表達(dá)明顯升高，p-AMPKα/AMPKα比值明顯增強(qiáng)(P<0.05)；苓桂術(shù)甘湯治療組p-AMPKα蛋白表達(dá)明顯減弱，p-AMPKα/AMPKα比值明顯降低(P<0.05)。

3 討論

根據(jù)結(jié)果顯示，腹腔注射多柔比星2周后，大鼠存在明顯的心力衰竭。其LVIDS增大，LVPWD和LVPWS變薄，EF和FS明顯下降，HW/BW升高。而給予苓桂術(shù)甘湯治療2周后，其各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善，提示苓桂術(shù)甘湯能改善心臟功能，具有抗多柔比星心肌毒性的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，苓桂術(shù)甘湯可能通過(guò)抑制AMPK活化，降低心肌游離脂肪酸，抑制脂肪酸氧化，增加ATP，改善心肌能量代謝，從而達(dá)到控制心力衰竭的作用。

苓桂術(shù)甘湯出自《金匱要略》“病痰飲者，當(dāng)以溫藥和之。[7]”本方重用茯苓為君，取其甘淡可健脾利水、滲濕化飲，以桂枝為臣，溫陽(yáng)化氣，平?jīng)_降逆。加用黃芪、丹參為臣，補(bǔ)其補(bǔ)氣活血之功。白術(shù)健脾燥濕為佐，炙甘草為使藥，一可助桂枝溫補(bǔ)中陽(yáng)之力，二可合白術(shù)益氣健脾，三可調(diào)和諸藥。有研究證實(shí)，苓桂術(shù)甘湯能改善心力衰竭大鼠心功能和左室重構(gòu)[8]。其他研究也證實(shí)，黃芪在臨床被廣泛應(yīng)用于治療慢性心力衰竭[9]，丹參能降低阿霉素所致的心臟毒性[10]，可減少心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟功能，降低心力衰竭風(fēng)險(xiǎn)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射多柔比星后，模型組左室內(nèi)徑增大，左室壁及右室壁均變薄，提示腹腔注射多柔比星后可導(dǎo)致全心的衰竭，這與文獻(xiàn)描述相似[12]。心力衰竭后單位質(zhì)量的心肌毛細(xì)血管及線粒體數(shù)目減少，使氧的彌散間距增大和氧利用能力降低，故心肌缺血缺氧，加劇心肌能量代謝障礙[13]。由此進(jìn)一步證實(shí)，苓桂術(shù)甘湯對(duì)多柔比星所致的心力衰竭具有保護(hù)作用。

能量代謝是心力衰竭重要的病理生理環(huán)節(jié)，其改變?cè)谛牧λソ叩陌l(fā)病機(jī)制中起重要作用，因此調(diào)節(jié)心臟的能量代謝有可能成為心力衰竭治療中的一種新方法[14]。心力衰竭時(shí)出現(xiàn)的心肌能量代謝異常通常與心功能異常相伴，并在底物利用、氧供、ATP產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用等多環(huán)節(jié)產(chǎn)生代償性變化，最后出現(xiàn)能量失代償。AMPK可以從代謝底物調(diào)控、線粒體功能等方面發(fā)揮作用，相互協(xié)調(diào)調(diào)控心肌能量代謝。AMPK可增加FFA的氧化而改善心力衰竭心肌FFA的積累[15]。心肌線粒體脂肪酸β-氧化 (FAO)產(chǎn)生的能量是心肌能量代謝的主要來(lái)源[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組FFA升高，而ATP下調(diào)，這與心力衰竭的心肌能量代謝障礙相一致[17]；苓桂術(shù)甘湯能降低FFA水平，提高ATP含量，提示苓桂術(shù)甘湯可能通過(guò)降低FFA水平，抑制脂肪酸氧化，增加ATP合成，改善心肌能量代謝，從而達(dá)到控制心力衰竭的作用。在心力衰竭缺血缺氧狀態(tài)下，AMP/ATP比值顯著增高使AMPK激活，其作用點(diǎn)是磷酸化AMPKα亞基172位蘇氨酸[15]。本研究模型組符合前述。有研究表明，AMPK的活化增強(qiáng)脂肪酸氧化，導(dǎo)致葡萄糖氧化降低，增加糖酵解有害副產(chǎn)品(乳酸和質(zhì)子)的堆積，使ATP主要用于清除這些副產(chǎn)品的堆積，而不是被利用于肌肉收縮，從而使心臟功能和效率降低[18]。苓桂術(shù)甘湯能降低AMP/ATP比值，抑制AMPK活化，增加ATP的合成，改善心肌能量代謝，從而達(dá)到控制心力衰竭的作用。