Vav3在小細胞肺癌組織中的表達及對細胞遷移和侵襲能力的影響

李大剛，李輝宗，康樂

（1.山東省臨沂市人民醫院東醫療區 呼吸內科，山東 臨沂 276000；2.山東省蒙陰縣中醫院 內三科，山東 蒙陰 276200）

小細胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）作為肺癌常見類型之一，約占原發性肺癌的20%左右[1]，由于該腫瘤侵襲力強、生長迅速且易早期轉移，多數患者臨床確診時已處于中晚期，盡管該腫瘤細胞對放化療敏感，但治愈率較低，多數患者治療后仍會復發或轉移，預后較差，5年生存率低于10%[2]。因此，積極探討影響SCLC高侵襲、轉移的相關機制對改善患者預后具有重要意義。Vav3作為原癌基因Vav家族重要成員，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達[3]，與腫瘤發生、轉移過程密切相關，在腫瘤細胞黏附、凋亡、遷移、侵襲中發揮關鍵性作用[4]。本研究通過檢測SCLC組織中Vav3表達，探討其與患者臨床病理特征之間的關系及對預后的影響，并利用小分子RNA干擾（small RNA interference,siRNA）技術抑制人小細胞肺癌H446細胞株，觀察其對細胞遷移和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 一般研究

1.1.1 臨床資料 選取2012年2月-2016年3月在臨沂市人民醫院東醫療區治療且臨床資料完整的SCLC患者87例，均經支氣管鏡、穿刺或手術獲取病理標本并明確診斷為單純性SCLC，術前均未接受放化療。其中，男性46例，女性41例；年齡33～79歲，平均（59.2±12.4）歲；臨床分期：局限期43例，廣泛期44例；61例具有吸煙史，40例發生遠處轉移。所有患者出院后均進行隨訪，方式包括門診和電話，隨訪截止2017年3月31日，未出現失訪病例，存活36例，死亡51例。另留取同期因肺外傷行手術治療的正常肺組織50例作為對照組，均排除惡性腫瘤患者。其中，男性29例，女性21例；年齡31～78歲，平均（60.1±12.9）歲。本研究通過醫院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑和設備 免疫組織化學（簡稱免疫組化）試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司，兔抗人Vav3多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，人小細胞肺癌H446細胞株購自美國ATCC公司，DMEM培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司，Vav3、內參引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，siRNA-Vav3、siRNA-對照序列由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成，LipofectamineTM2000轉染試劑、Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉錄、PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，Transwell小室購自美國Costar公司，實時熒光定量PCR儀（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）購自美國ABI公司，恒溫培養箱購自常州邁科諾儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 組織中Vav3蛋白表達的檢測 取SCLC和對照組組織，甲醛固定、石蠟包埋、切片，厚度約4 μm，用二甲苯脫蠟，經梯度酒精脫水，用3% 過氧化氫H2O2浸泡10 min以消除內源過氧化物酶影響，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）沖洗3次，置于枸櫞酸（pH 6.0）液中煮沸15 min，用1%血清工作液封閉，室溫孵育25 min。加入一抗兔抗人Vav3多克隆抗體（稀釋比例1∶500），4℃過夜孵育，PBS沖洗3次，加入二抗，室溫下靜置120 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine,DAB）顯色，蘇木素復染，脫水透明后封片，以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：以細胞質中出現淡黃色或黃褐色顆粒狀或斑塊狀染色作為陽性，采用半定量法積分法進行結果判定[5]：①染色強度：0分：無染色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色；②陽性細胞比例：0分：無著色細胞；1分：陽性細胞比例≤10%；2分：10%＜陽性細胞比例＜25%；3分：陽性細胞比例25%～50%；4分：陽性細胞比例≥50%；③將染色強度評分和陽性細胞比例評分之和作為最終結果，陰性：≤2分，陽性：＞2分。所有結果判定均采用盲法由2位病理科主治醫師單獨完成，出現結果不一致時由病理科主任醫師作出最終判定。

1.2.2 細胞培養及分組處理 取人小細胞肺癌H446細胞株，置于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，在含5%二氧化碳CO2的37℃恒溫培養箱中培養[6]。消化后，傳代培養，取對數生長期細胞完成實驗。對細胞進行轉染并分組。①siRNA-Vav3組，轉染Vav3干擾序列：正向5'-GGAAGGGTTCAGAACCTTA-3'，反向5'-GAAGATCTCTATGACTGTG-3'；②siRNA-對照序列組，轉染對照序列：正向5'-UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT-3'，反向5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白組，不作任何處理。轉染后培養48h完成后續實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測各組細胞中Vav3基因表達 取各組轉染后培養48h細胞，加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒獲得總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA純度，以A260/A280在1.80～2.30為合格。逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA[7]，以cDNA作為模板進行PCR。引物序列：VAV3正向5'-TGAAGGCAGAGGAAGCACAT-3'，反向5'-GCATAG GAACCACAAGCAAGT-3'；β-Actin 正向 5'-GTCATTC CAAATATGAGATGCGT-3'，反向 5'-GCATTACATAAT TTACACGAAAGCA-3'[7]。PCR反應條件：95℃預變性1min，94℃變性30s，58℃退火30s，74℃延伸30s，連續循環38次。每個樣品均設3個平行反應復孔。用2-△△Ct法計算各組細胞中Vav3基因相對表達量。

1.2.4 劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 取各組轉染后培養48h細胞，按2×105個/ml接種于6孔板，待細胞融合度達90%以上時，用200μl槍頭于垂直于孔板劃直線，且寬度相同，將散落細胞用PBS液去除，分別于0和24h時觀察細胞遷移情況并拍照，用Image J圖像分析軟件分析劃痕愈合率=（1～24h時劃痕面積/0h時劃痕面積）×100%。

1.2.5 Transwell法檢測各組細胞遷移和侵襲能力 ①遷移能力檢測：取各組轉染后培養48h細胞，胰酶消化后，接種于6孔板，調整細胞密度為2×106個/ml，取200μl加入到Transwell小室上室，將600μl含20%胎牛血清的培養液加入小室下室，培養12h，多聚甲醛固定15min，結晶紫染色15min，將散落細胞用棉簽輕輕去除，PBS沖洗后，顯微鏡觀察，隨機取5個視野計數穿膜細胞數。②侵襲能力檢測：將50μg Matrigel膠平鋪于Transwell小室上室，風干后以備檢。其余步驟同遷移能力檢測[7]。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCLC和對照組組織中Vav3蛋白表達比較

SCLC組織中Vav3蛋白陽性表達率為81.6%（71/87），對照組為14.0%（8/50），兩組比較，差異有統計學意義（χ2=17.739，P=0.000），SCLC組織中Vav3蛋白陽性表達率高于對照組。見圖1。

圖1 兩組組織中Vav3蛋白表達（免疫組化×200或400）

2.2 SCLC組織中Vav3蛋白表達與臨床病理特征之間的關系

SCLC組織中Vav3蛋白表達與性別、年齡、腫瘤位置及吸煙無關（P＞0.05），而與臨床分期、遠處轉移和生存狀態有關（P=0.024、0.016和0.014）。見表1。

2.3 SCLC組織中Vav3蛋白表達對預后的影響

Vav3蛋白陽性表達組患者平均生存時間23.14個月，總生存率為35.21%；而Vav3蛋白陰性表達組則為44.89個月，總生存率為68.75%。Vav3蛋白陽性表達組與陰性表達組比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=6.280，P=0.012），Vav3蛋白陽性表達組患者平均生存時間低于Vav3蛋白陰性表達組。見圖2。

2.4 各組細胞中Vav3基因表達比較

siRNA-Vav3組、siRNA-對照序列組和空白組細胞中Vav3 mRNA相對表達量分別為（1.17±0.23）、（2.19±0.14）和（2.25±0.16），經方差分析，差異有統計學意義（F=68.751，P=0.000），siRNA-Vav3組細胞中Vav3 mRNA相對表達量低于siRNA-對照序列組和空白組，見圖3。

表1 SCLC組織中Vav3蛋白表達與臨床病理特征之間的關系 例（%）

圖2 SCLC組織中Vav3蛋白表達對患者預后的影響

圖3 各組細胞中Vav3基因表達

2.5 各組細胞遷移能力比較

劃痕實驗結果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對照序列組和空白組細胞24 h后劃痕愈合率分別為（12.80±1.54）%、（29.19±3.23）% 和（27.74±1.50）%，經方差分析，差異有統計學意義（F=98.539，P=0.000），siRNA-Vav3組細胞24 h后劃痕愈合率低于siRNA-對照序列組和空白組，見圖4。Transwell實驗結果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對照序列組和空白組遷移細胞數分別為（87.01±7.68）、（108.54±6.47）和（111.13±11.71）個，經方差分析，差異有統計學意義（F=13.261，P=0.000），siRNA-Vav3組遷移細胞數低于siRNA-對照序列組和空白組，見圖5。

圖4 劃痕實驗檢測各組細胞愈合能力

2.6 各組細胞侵襲能力比較

Transwell實驗結果顯示，siRNA-Vav3組、siRNA-對照序列組和空白組侵襲細胞數分別為（97.18±9.11）、（125.52±9.66）和（130.00±9.98）個，經方差分析，差異有統計學意義（F=20.664，P=0.000），siRNA-Vav3組侵襲細胞數低于siRNA-對照序列組和空白組，見圖6。

圖5 各組細胞遷移能力比較 （結晶紫×200）

圖6 各組細胞侵襲能力比較 （結晶紫×200）

3 討論

SCLC作為肺癌常見類型，近年來發病率不斷升高，臨床上主要以全身化療聯合放療、手術作為主要治療方式，但治療效果有限[8]。雖然SCLC細胞對化療敏感，但極易產生多藥耐藥，出現復發[9]。有研究指出[10]，SCLC細胞高侵襲、轉移能力是影響患者治療效果及預后的主要因素。因此，積極探討影響SCLC高侵襲、高轉移能力的相關機制，對改善患者預后具有重要意義。Vav3是癌基因家族重要成員，可通過促進三磷酸鳥苷（GTP）酶活化而參與信號轉導，在基因轉錄及細胞轉化中發揮作用[11]，同時亦可通過影響Rho家族分子間相互作用而對細胞極性、黏附能力等產生影響[12]。現已證明，Vav3在多種惡性腫瘤組織中呈高表達[13]，在調控腫瘤發生、轉移、侵襲等過程中發揮重要關鍵性作用[14]。本研究結果顯示，Vav3蛋白在SCLC組織中陽性表達率高于對照組，說明Vav3蛋白在SCLC組織中呈高表達，提示Vav3蛋白可能參與SCLC發生過程。進一步分析與臨床病理特征之間的關系，結果顯示，SCLC組織中Vav3蛋白表達與臨床分期、遠處轉移和生存狀態有關（P＜0.05），廣泛期、發生遠處轉移和死亡患者組織中Vav3蛋白表達量增加，提示Vav3蛋白可能參與SCLC侵襲轉移過程，且與患者預后有關。Kaplan-Meier生存分析顯示，SCLC組織中Vav3蛋白陽性表達組患者總生存率低于Vav3蛋白陰性表達組，進一步表明SCLC組織中Vav3蛋白表達與患者預后密切相關。

為進一步探討Vav3在SCLC侵襲轉移中的作用，本研究利用siRNA技術特異性沉默H446細胞中Vav3基因，結果顯示，siRNA-Vav3組細胞中Vav3 mRNA相對表達量低于siRNA-對照序列組和空白組，說明H446細胞中Vav3基因被成功抑制。研究表明[15]，Vav3及其反向信號分子可通過參與調控機體內多條信號轉導，而在腫瘤細胞黏附、侵襲、轉移中發揮重要作用。本研究劃痕實驗和Transwell實驗結果均顯示，siRNA-Vav3組劃痕愈合率和遷移細胞數均低于siRNA-對照序列組和空白組，說明特異性沉默H446細胞中Vav3基因可有效抑制細胞遷移能力，同時，本研究結果顯示，siRNA-Vav3組侵襲細胞數低于siRNA-對照序列組和空白組，說明特異性沉默H446細胞中Vav3基因可有效抑制細胞侵襲能力，本結果表明，Vav3基因在小細胞肺癌H446細胞遷移、侵襲過程中發揮重要作用。

綜上所述，Vav3蛋白在SCLC組織中呈高表達，且與患者預后密切相關，特異性沉默SCLC細胞中Vav3基因可抑制細胞遷移和侵襲能力，有望為SCLC綜合防治提供新的靶點。