重組腐敗梭菌α毒素對兔的免疫效力分析

陳小云，劉 瑩，薛 麒，朱 真，李啟紅，印春生，姚文生，康 凱，杜吉革

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

腐敗梭菌是一種能夠引起人以及牛、羊、馬、豬、水貂、雞等多種動物發病的厭氧菌[1-6]，對人類的健康和畜禽養殖業危害極大[7-8]。本菌的主要感染途徑是創傷感染，從而引起機體的惡性水腫。此外，腐敗梭菌可通過消化道感染機體，引起一種非接觸性的急性致死性傳染病[7]。目前，通過滅活腐敗梭菌培養物上清而制備的天然類毒素疫苗是預防該菌感染的主要疫苗，但該類疫苗制備過程繁瑣，抗原成分復雜，有效抗原含量較低。因此，篩選純凈有效的抗原用于研制新型腐敗梭菌病疫苗，對未來預防該菌感染具有重要意義。

腐敗梭菌能產生4種主要外毒素，分別為α、β、γ以及δ[9-12]。其中，α毒素被證明是一種關鍵的致死性毒力因子，并且與致病性有直接的關系[13-17]。該毒素以相對分子質量46～48 ku的低活性或無活性的前體毒素形式分泌后，前體毒素可在蛋白酶的活性作用下水解掉C 端45個氨基酸，形成活化形式[18-19]。α毒素具有溶血、細胞毒性、壞死和致死等生物活性[14-17]，對常見實驗用細胞(如CHO、Vero、MDCK)和人的上皮細胞等均有毒性[20-22]。該毒素在37 ℃的條件下，經0.5%～0.8%的甲醛溶液處理3～6 d后即可成功脫毒成為類毒素[23]。張燕等[24]及彭國瑞[25]分別通過原核表達載體pQE30和pET28a表達腐敗梭菌α毒素，結果發現重組α毒素大部分以包涵體的形式存在，且該蛋白對腐敗梭菌天然毒素有一定的免疫保護作用。此外，彭國瑞等[23]的研究發現，少量可溶性的重組α毒素具有與天然毒素相似的細胞毒性和小鼠致死性等特性。然而，上述研究者均未對重組α毒素進行純化，無法對重組毒素的免疫保護性和毒力進行準確定量。已有的研究發現，將目的基因按照大腸桿菌偏好的密碼子進行優化后可明顯提高目的蛋白的可溶性表達[26-29]。為此，作者對我國現行腐敗梭菌滅活疫苗的制苗用菌株(C55-1株)α毒素的編碼基因按大腸桿菌偏愛的密碼子進行了優化設計和人工合成，通過原核系統表達后進行純化，并對其純化蛋白的毒力以及免疫原性進行了研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

腐敗梭菌C55-1株(CVCC60021)、腐敗梭菌C55-1株天然毒素、腐敗梭菌抗血清(兔源)、犬腎細胞(MDCK細胞)以及pET-30a(+)(簡稱pET)表達載體均為本實驗室保存；1.5～2.0 kg普通級健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受態細胞Top10和BL21(DE3)購自北京全式金生物技術有限公司；Montanide ISA 201佐劑購自法國賽彼科(Seppic)公司；Ni-IDA親和層析介質試劑盒、蛋白Marker、Western blot Marker均購自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)購自東洋坊公司；premixTaqversion 2.0、DNA Marker購自TaKaRa公司。T4連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自Promaga公司；限制性內切酶BamHⅠ和HindⅢ購自NEB公司；抗His標簽單抗、Bradford蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司；HRP標記的山羊抗鼠IgG以及山羊抗兔IgG均購自中山金橋公司。

1.2 基因合成及密碼子優化

按大腸桿菌偏愛的密碼子對已知的腐敗梭菌C55-1株α毒素編碼基因進行優化設計[25]，并在該基因后添加6*His標簽蛋白編碼序列。由中美泰和公司人工合成基因片段Gcsa。

1.3 重組α毒素原核表達載體的構建

以Gcsa基因為模板，采用引物對csa-F/csa-R進行PCR擴增。其中上游引物csa-F序列：5′-CGCGAATCCATGACTAATCTGGAG-3′，其5′端引入限制性內切酶BamHⅠ位點(下劃線部分)及保護性堿基；下游引物csa-R序列：5′-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATGATG-3′，其5′端引入限制性內切酶HindⅢ位點(下劃線部分)及保護性堿基。PCR體系為50 μL。PCR反應條件：94 ℃ 預變性4 min；98 ℃變性10 s，56℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，共33個循環；最后68 ℃延伸7 min。

回收擴增得到的DNA條帶，采用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切消化后，與經過相同酶切消化的pET-30a(+)載體連接。將連接好的質粒轉化Top10感受態細胞，挑取單克隆至含有卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養過夜，提取質粒。對所提質粒進行PCR和雙酶切鑒定，將鑒定結果為陽性的質粒送中美泰和公司測序，測序正確的質粒命名為pcsa。

1.4 重組蛋白的表達與鑒定

將質粒pcsa和空載體pET分別轉化BL21(DE3)感受態細胞，并分別在15和37 ℃的條件下用IPTG誘導表達，收集菌體，超聲破碎后分別收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況及其可溶性，并以BSA蛋白為標準，利用灰度掃描的方法進行相對表達量和可溶性比例的統計，將表達的重組蛋白稱為rCSA。采用Western blot方法，以抗His標簽蛋白抗體為一抗，對重組蛋白進行進一步的鑒定。

1.5 重組蛋白的純化及Western blot鑒定

按照Ni-IDA親和層析介質試劑盒的使用說明書對菌體裂解上清中呈可溶性表達的重組蛋白進行純化，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，-80 ℃保存備用。將純化后的重組蛋白經SDS-PAGE電泳后轉印至PVDF膜上，以腐敗梭菌抗血清為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗進行孵育，按照底物顯色試劑盒說明書進行顯色，檢測純化的重組蛋白與腐敗梭菌抗血清的反應情況。

1.6 重組蛋白的毒力測定

1.6.1 細胞毒力測定 將MDCK細胞接種96孔細胞培養板，置37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養至形成細胞單層后，棄細胞生長液。將純化的rCSA及天然毒素用細胞維持液做10-1～10-10倍系列稀釋，每個稀釋度各接種3孔細胞，100 μL·孔-1，置37 ℃、 含5% CO2的培養箱中培養24 h，觀察并記錄細胞的病變情況。同時將胃肝肉酶消化湯和洗脫液用細胞維持液稀釋100倍后，分別孵育細胞，作為陰性對照組。

1.6.2 小鼠毒力測定 已有的研究發現10 μg ·kg-1的天然腐敗梭菌α毒素即可引起小鼠死亡[10]。本研究根據《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)三部中的規定[30]，選擇尾靜脈注射的方法來檢測重組蛋白對小鼠的毒力。將16～18 g ICR小鼠隨機分組，每組5只。首先設置1.5、3和6 μg三個劑量梯度，根據小鼠的存活狀況再進行倍比稀釋。同時，設置蛋白洗脫液、肉肝胃酶消化湯兩個陰性對照和1個小鼠MLD的天然毒素作為陽性對照。樣品均用明膠緩沖液進行稀釋，注射的液體總體積為200 μL，觀察3 d，記錄小鼠的存活狀態。

1.7 免疫原性分析

1.7.1 重組蛋白的脫毒 用終濃度為0.8%的多聚甲醛溶液對rCSA進行脫毒，具體條件為37 ℃， 作用4 d。將脫毒后的rCSA以1.5、3和6 μg 的劑量靜脈注射16～18 g ICR小鼠，觀察3 d，以檢測rCSA的脫毒效果。

1.7.2 免疫程序 將脫毒成功的rCSA與Montanide ISA 201佐劑以1∶1的比例配制成rCSA終濃度為50 μg·mL-1的疫苗，另取滅菌PBS與Montanide ISA 201佐劑以1∶1的比例制備對照疫苗，置4 ℃保存備用。選用體重1.5～2.0 kg健康家兔，并在免疫前測定每只家兔血清對腐敗梭菌毒素的中和效價，取8只對腐敗梭菌毒素的中和效價為0的家兔，其中4只頸部皮下注射疫苗，2.0 mL·只-1， 免疫后14 d，以相同劑量、相同途徑進行第二次免疫。另外4只以相同劑量、相同途徑和相同方法免疫對照疫苗作為對照組。

1.7.3 血清中和效價測定 在首免后14 d以及二免后21 d，分別對試驗組及對照組所有家兔血清進行分離，并按照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)三部中規定的方法測定血清的中和抗體效價[30]。

1.7.4 毒素攻毒試驗 二免后21 d，對免疫組及對照組所有家兔通過耳緣靜脈各注射1個家兔MLD的腐敗梭菌天然毒素進行攻毒，觀察5 d，記錄家兔的死亡情況。根據免疫組及對照組家兔的死亡情況，判定試驗疫苗的免疫保護效力。

2 結 果

2.1 重組α毒素原核表達載體的構建

采用引物csa-F/csa-R進行PCR擴增，擴增片段經酶切后克隆至pET載體上。獲得的重組質粒的雙酶切電泳結果如圖1所示，酶切后出現大小約5 kb的載體DNA片段，以及大小約1 260 bp的目的基因片段，與預期相符。測序結果表明，插入的外源基因序列正確，將此質粒命名為pcsa。

1. DL5000 DNA相對分子質量標準; 2. 重組質粒pcsa BamHⅠ和HindⅢ的雙酶切鑒定1. DL5000 DNA marker; 2. pET30a-Gcsa digested with BamHⅠ and HindⅢ圖1 重組原核表達質粒pcsa的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant prokaryotic expression plasmids pcsa

2.2 重組α毒素的原核表達與鑒定

將pcsa以及pET分別轉化BL21(DE3)感受態細胞并誘導表達。SDS-PAGE和Western blot檢測結果顯示，表達的rCSA相對分子質量約為52 ku，大小與預期相符，rCSA在BL21(DE3)菌體中以可溶性和包涵體兩種形式存在(圖2)。圖2a為rCSA表達的SDS-PAGE鑒定結果，如圖所示，37 ℃、誘導4 h后，rCSA的表達量以及可溶性均優于其他誘導條件。以BSA蛋白為標準，利用灰度掃描計算得出rCSA相對表達量為30 mg·L-1，可溶比例為50%。為此，確定rCSA的最適誘導表達條件為37 ℃，IPTG誘導4 h，收獲細胞裂解上清。圖2b為rCSA的Western blot鑒定結果，如圖所示，rCSA能與抗His標簽抗體發生反應，證明rCSA含有His標簽，與預期相符。

a.重組蛋白表達的SDS-PAGE鑒定；b.重組蛋白與抗His單抗反應的Western blot； M1. 蛋白質相對分子質量標準； M2. Western blot蛋白質相對分子質量標準；PC1. BSA (1 μg)；PC2. BSA (2 μg)； pET. pET 37 ℃、4 h誘導的細胞裂解物；1. pcsa，15 ℃、16 h誘導的細胞裂解物；2. pcsa，37 ℃、4 h誘導的細胞裂解物；pET1. pET，37 ℃、4 h誘導的細胞裂解上清；pET2. pET，37 ℃、4 h誘導的細胞裂解沉淀；3. pcsa，15 ℃、16 h誘導的細胞裂解上清；4. pcsa，15 ℃、16 h誘導的細胞裂解沉淀；5. pcsa，37 ℃、4 h誘導的細胞裂解上清；6. pcsa，37 ℃、4 h誘導的細胞裂解沉淀a.The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b. The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot; M1. Protein marker; M2. Western blot marker；PC1. BSA (1 μg); PC2. BSA (2 μg); pET. The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 1. The cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2. The cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET1. The supernatant of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; pET2. The precipitation of cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 3.The supernatant of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4. The precipitation of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 5. The supernatant of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6. The precipitation of cell lysates of pcsa induced with IPTG for 4 h at 37 ℃圖2 rCSA的原核表達與鑒定Fig.2 Prokaryotic expression and identification of rCSA

2.3 rCSA的純化與鑒定

如圖3所示，按照Ni-IDA親和層析介質試劑盒說明書對rCSA進行純化，收集純度較高的洗脫液(50及500 mmol·L-1Imidazole的洗脫液)進行透析，最終獲得的蛋白質質量濃度為1.5 mg·mL-1，純度可達90%以上。將純化后的rCSA經SDS-PAGE后轉印到PVDF膜上進行Western blot檢測。結果顯示，rCSA能夠與腐敗梭菌抗血清發生反應(圖4)。

2.4 rCSA的毒力測定

2.4.1 對MDCK細胞的毒力測定 MDCK細胞加入各組分后繼續培養24 h，顯微鏡下觀察。天然腐敗梭菌α毒素各稀釋度(10-2～10-4)以及rCSA各稀釋度(10-4～10-7)接種細胞組出現了不同程度的細胞病變，且隨著稀釋度的增加，細胞的病變程度隨之減弱。空白對照、肉肝胃酶消化湯和洗脫液對照組細胞生長良好。這說明0.15 ng·mL-1的蛋白即可引起MDCK細胞發生明顯的細胞病變。

M. 蛋白質相對分子質量標準; 1.細胞裂解物上清；2.上清與Ni-IDA孵育后流出液；3. 20 mmol·L-1 Imidazole的洗脫液；4. 50 mmol·L-1 Imidazole的洗脫液；5. 500 mmol·L-1 Imidazole 的洗脫液M. Protein marker; 1. The supernatant of cell lysates after centrifugation; 2. The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant; 3. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 20 mmol·L-1 Imidazole); 4. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 50 mmol·L-1 Imidazole); 5. The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 500 mmol·L-1 Imidazole)圖3 rCSA的純化Fig.3 Purification of rCSA

M. 蛋白質相對分子質量標準；1. pET 37 ℃、4 h誘導的細胞裂解物；2. 純化后的rCSAM. Protein marker; 1. The cell lysates of pET induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 2. rCSA after purification圖4 rCSA與腐敗梭菌抗血清反應的Western blot鑒定Fig.4 The identification of rCSA after purification with antitoxin serum of Clostridium septicum by Western blot

2.4.2 對小鼠的毒力測定 如表1所示，以1.5、3及6 μg的rCSA三個劑量注射組的5只小鼠在10 min之內全部死亡，隨后，對1.5 μg的劑量組作2倍系列稀釋，并測定各稀釋度對小鼠的毒力。結果顯示，0.046 88 μg的rCSA注射組的5只小鼠在3 d內全部死亡，而0.023 44 μg的rCSA注射組小鼠在3 d內死亡2只。為此，判定rCSA對ICR小鼠的MLD為1.302～1.465 μg·kg-1。

表1 樣品的稀釋方法以及小鼠存活情況

S.存活；D .死亡

S. Survived; D. Died

2.5 rCSA的免疫原性分析

2.5.1 抗rCSA兔血清的中和抗體效價測定 經多聚甲醛滅活的rCSA分別以1.5、3以及6 μg的劑量尾靜脈注射小鼠，各組小鼠均存活(數據未顯示)，說明rCSA已成功脫毒。以無毒力的rCSA制備疫苗免疫家兔后，血清中和抗體效價測定結果如表2所示，每毫升的一免抗血清可中和100～130個 小鼠MLD的腐敗梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和360～480個小鼠MLD的腐敗梭菌毒素，而佐劑對照組的兔血清對腐敗梭菌毒素無中和作用。

2.5.2 攻毒保護性試驗 在二免后21 d，對所有rCSA免疫組和佐劑免疫對照組的家兔，經耳緣靜脈注射1個兔MLD的腐敗梭菌天然毒素，結果佐劑免疫對照組家兔在攻毒后5 d內全部死亡，rCSA免疫組家兔全部健活，未見任何不良反應(表2)。

表2 抗rCSA的兔血清的中和抗體效價及rCSA的免疫保護結果

S.存活；D .死亡

S. Survived; D. Died

3 討 論

基因工程亞單位疫苗研制的關鍵是免疫原的篩選與鑒定。因此，作為腐敗梭菌最重要致死性毒力因子和保護性抗原[13-17]的α毒素，成為眾多學者的研究對象。已有的研究發現，重組α毒素大部分以包涵體的形式存在[24-25]，而本研究對α毒素基因進行密碼子優化后，通過pET30a成功表達了重組腐敗梭菌α毒素，并使該重組蛋白的可溶性比例達到50%，利于大量生產和純化。此外，本文獲得的重組α毒素仍具有很強的細胞毒性和小鼠毒性，從而為α毒素致病分子機制的進一步研究提供了良好的實驗材料。

由于腐敗梭菌引起的疾病病程短促，如不及時對癥治療，動物會迅速死亡。因此，免疫接種是預防這類疫病最有效的途徑。目前，我國已批準的商品化腐敗梭菌病疫苗主要有羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯滅活疫苗，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯滅活疫苗等，但該類疫苗均為天然毒素經甲醛脫毒后制備的類毒素疫苗，其生產過程中需采用肉肝胃酶消化湯等天然成分較多的培養基，難以保證批間一致性，易導致產毒不穩定。此外，其抗原成分復雜，有效抗原含量較低，導致各菌株的類毒素免疫劑量均較高，制備聯苗后免疫劑量過大，容易引起動物的應激反應。如曾經廣泛使用的“羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯滅活疫苗”，因免疫劑量為每只羊5 mL，現已難以被養殖戶所接受。現行《中華人民共和國獸藥典》(2015年版)三部中規定，在此類疫苗檢驗中，抗腐敗梭菌毒素的兔血清中和抗體效價達到10個小鼠MLD·mL-1即可判為合格。雖然該標準為疫苗的最低標準，但從中國獸醫藥品監察所歷年的獸用生物制品監督檢驗結果來看，目前我國該類疫苗的免疫效力不容樂觀，疫苗抽檢不合格的情況時有發生(http://www.moa.gov.cn/zwllm/tzgg/tz/201504/t20150402_4472055.htm)。彭小兵等[31]對自2006年至2015年間的此類疫苗檢驗結果的統計發現，以血清中和法檢驗后效力不符合規定的產品共有33批，其中產氣莢膜梭菌β毒素組分效力不符合規定的比例最高，約為72.7%。然而，鑒于此類聯苗免疫劑量的限制，無法再大程度增加β類毒素的比例。為此，梭菌毒素亞單位疫苗的研制顯得極為重要。在一定的范圍內，我們可以最大幅度地增大免疫原性較差的毒素抗原(如β類毒素)，從而提高聯苗的總體免疫保護作用。而本研究中制備的rCSA一免兔血清每毫升可中和100～130個小鼠MLD的腐敗梭菌毒素，中和效價約為目前的商品化疫苗腐敗梭菌部分的10～13倍，效果明顯提高，從而為腐敗梭菌以及梭菌類毒素基因工程類亞單位疫苗的研制提供了良好的候選抗原。

4 結 論

人工合成腐敗梭菌α毒素基因片段Gcsa，將其克隆至pET-30a(+)進行表達與純化，成功獲得重組腐敗梭菌α毒素——rCSA。rCSA為可溶性表達，比例可達50%，且能與腐敗梭菌抗血清反應。0.15 ng·mL-1的rCSA即可在MDCK引起明顯的細胞病變；rCSA對ICR小鼠的最小致死量是1.5×106ng·kg-1。rCSA經甲醛脫毒后制成疫苗免疫家兔，二免抗血清可中和360～480個小鼠MLD的腐敗梭菌毒素；rCSA免疫家兔能耐過1個家兔MLD的腐敗梭菌毒素的攻毒。可見，rCSA具有良好的免疫原性，可作為腐敗梭菌病基因工程亞單位疫苗的候選抗原。