蒙漢族散發性乳腺癌患者BRCA1 基因exon11突變分析

馬金柱,劉 明,張信來,布日古德

0 引言

近年來的研究資料顯示，乳腺癌在我國女性中的發病率呈上升趨勢，且逐年增加，成為嚴重危害我國婦女健康的主要惡性腫瘤之一。研究表明，在我國女性新發腫瘤中乳腺癌占據首位，并且增加比例最為顯著[1]。但迄今為止，乳腺癌的發病機制尚未完全闡明，其發生發展有多因素多基因參與[2]，也是環境與遺傳因素交叉作用的結果[3-4]，一級親屬中具有乳腺癌者占全部乳腺癌患者的5%，且在遺傳性乳腺癌患者中，50%以上的乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility gene,BRCA1)和乳腺癌易感基因2(Breast cancer susceptibility gene,BRCA2)陽性，BRCA1是近年來研究的熱點，相關研究發現，BRCA1在癌組織中呈高表達，且這種高表達具有種族差異性，同時，基因變異多見于BRCA1基因 exon11上[2，5]。本研究對我院103例乳腺癌患者BRCA1基因 exon11進行測序，擬分析蒙漢族散發性乳腺癌患者與BRCA1基因exon11基因變異的關系，為臨床乳腺癌的防治提供一定理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象及病史采集 選取2010年9月至2014年1月，于我院甲狀腺乳腺外科住院診治、經過病理活檢確診為散發性乳腺癌的女性患者，本研究經我院醫學倫理委員會批準及知情同意。

1.2 病例納入標準 經過病理組織學確診為散發性乳腺癌的患者；排除任何職業致癌物接觸史；采血前未經過任何抗癌治療。所有的蒙、漢族研究對象都要求祖孫三代均居住于內蒙古地區、無異族通婚史、無血緣關系且無乳腺癌家族史。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集及處理 分別抽取被檢測者外周靜脈血樣本2 ml，于EDTA2管中抗凝，顛倒混勻，核對清晰標記，在-80 ℃低溫冰箱中保存備用。

1.3.2 基因組DNA提取 嚴格按照血液基因組DNA提取試劑盒TIANamp Blood DNA Kit(離心柱-目標號：DP318)操作說明書進行基因組DNA提取，將提取DNA濃度用Thermo(NANODROP2000)儀器檢測所提取DNA的濃度。

1.3.3 DNA濃度和純度測定 使用DU-88紫外分光光度計測定DNA的濃度及純度。設定紫外光波長，分別測定230 nm、260 nm、280 nm波長時的OD值。將樣品DNA 2 μl用TE緩沖液稀釋100倍后，分別記錄好編號、稀釋度。DNA樣本的濃度(μg/μl):OD260×稀釋倍數×50；DNA樣本的純度：OD260/OD280≈1.8(>1.9時表明有RNA的污染；<1.6時表明有蛋白質、酚等的污染)，計算各樣本的濃度和純度并作標記后，置于-20 ℃的冰箱中備用。按照隨機原則抽取部分樣本的DNA 4 μl，用2%瓊脂糖凝膠電泳來進一步鑒定樣本DNA有無降解。

1.4 BRCA1基因 exon11 PCR擴增 委托上海生工有限公司合成BRCA1基因 exon11引物，每一對引物可擴增長度為700 bp，將BRCA1基因 exon11區域全長分段擴增，嚴格按照TAKARA PCR Amplification Kit (Code No.：DR011)使用說明進行PCR實驗。

1.5 DNA目的片段的序列測定及分析 取待測序樣本以及其上、下游引物各20 μl，干冰保存送至天津生物芯片公司進行序列測定，該公司序列測定通過PCR-SSCP和基因測序技術方法完成。測序數據分析：將測序結果應用NCBI數據庫中的BLAST應用程序與數據庫中的BRCA1基因 exon11目的序列進行對比，從而確定是否為新的突變位點，且根據HUGO推薦的規則命名。

1.6 統計學分析 采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計學相關性分析。對所有數據均進行正態性檢驗，年齡差異采用t檢驗；計數資料，如民族、淋巴結轉移、病理類型、免疫組化、分級情況等比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 最終納入經過病理活檢確診為散發性乳腺癌的女性患者103例，包括蒙古族42例，漢族61例，年齡為28～77歲，平均年齡(56.27±10.39)歲。依據WHO標準(2003年)乳腺癌組織分級標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。以上乳腺癌患者中非浸潤性導管癌52例，浸潤性導管癌51例。所有患者中無淋巴結轉移者55例，有淋巴結轉移者48例。檢測雌激素受體(ER)陽性者54例，ER陰性者49例。檢測孕激素受體(PR)陽性者51例，陰性者52例。Cer-2基因表達陰性者53例，表達陽性者50例。所有入組樣本滿足蒙、漢族的年齡分層、病理分級、免疫組化情況和淋巴結轉移情況的差異無統計學意義，從而保證入組樣本在蒙古族及漢族之間的可比性。見表1。

表1 入組標本一般情況均衡性比較(例)

2.2 BRCA1基因外顯子11擴增電泳圖 見圖1。

2.3 BRCA1基因exon11突變檢測結果 患者BRCA1基因 exon11的測序結果顯示，2例漢族患者BRCA1基因致病性突變(2/103，1.94%)，1例為W372X無義突變，另1例為2073delA移碼突變，且均為發生在三陰乳腺癌病例中，并且均被收錄于NCBI數據庫中，蒙古族患者未發現BRCA1基因 exon11突變。見圖2、表2。

圖1 BRCA1基因外顯子11擴增電泳圖

圖2 BRCA1 2例基因突變

2.4 統計分析BRCA1基因exon11突變情況 在103例蒙、漢族散發性乳腺癌患者BRCA1基因exon11上共發現突變2例(1例為W372X無義突變，另1例為2073delA移碼突變)，該2例均發生在漢族患者，乳腺癌BRCA1基因蒙、漢族突變率的差異無統計學意義(P=0.614)；兩組患者病理類型中乳腺浸潤性導管癌占多數(P=0.750)；兩組間病理組織分級比較差異無統計學意義；BRCA1突變乳腺癌患者的臨床分期早于未突變組，但差異無統計學意義(P=0.781)。

3 討論

隨著分子生物學的發展，患乳腺癌的高危人群已經成為不容忽視的群體，而針對這些特殊群體進行靶向化學預防已經迫在眉睫。盡管在乳腺癌的診斷、治療及預防等方面已經取得進步，但仍面臨著巨大挑戰。自1994年，Miki等[6]克隆BRCA1序列后，國內外學者們研究發現，該基因與乳腺癌密切關聯，攜帶該基因突變患者發生乳腺癌的風險顯著增高，尤其多見于早發性乳腺癌及家族性乳腺癌患者[7]。BRCA1基因位于人類17號常染色體長臂2區1帶(17q21)，含有外顯子24個，長度為117 kb。BRCA1的基因突變多集中于2、11、20等外顯子上[8-9]。在不同種族、不同人群間的乳腺癌的發病率差異有統計學意義。研究表明，散發性乳腺癌患者中，30%左右的患者BRCA1基因的mRNA呈低表達；進一步的研究指出，女性BRCA1基因的胚系突變乳腺癌中，超過80%不表達孕激素受體(Progestrone receptor,PR)、雌激素受體(Estrogen receptor,ER)和Her-2。這種PR、ER及Her-2均為陰性或缺少的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)，由于缺乏靶點治療，其治療面臨著更大挑戰[10-11]。近年來，研究發現，BRCA1基因的表達異常與TNBC有著密切聯系。本研究結果發現，在103例蒙、漢族散發性乳腺癌患者BRCA1基因exon11中，有2例檢測出突變，1例為W372X無義突變，另1例為2073delA移碼突變，并且通過病理活檢確診上述2例為TNBC。TNBC的發生與BRCA1基因的突變及功能缺失而導致的同源重組介導的DNA雙鏈斷裂修復功能受損有關。Tun 等[11]研究發現，約22%的TNBC患者存在BRCA1突變，BRCA1的突變率在TNBC患者中約為非TNBC患者的5.6倍。Loke等[12]研究表明，BRCA1突變是通過改變蛋白結合位點導致細胞內的BRCA1表達量的變化。另一項研究發現，TNBC的發生、發展與BRCA1甲基化聯系密切，BRCA1啟動子甲基化可導致BRCA1表達水平減少[13]。因此，猜測本實驗基因測序發現的BRCA1突變可能參與了TNBC的發生、臨床分期和發展。

表2 BRCA1基因第11外顯子突變檢測結果

在一些特定的群體中，因生態學原因導致的某種類型基因的突變頻率極高，這種效應稱為“始祖效應”(Founder effect)。近年研究指出,散發性乳腺癌的發病風險與基因突變及基因的多態性等呈相關性，因地域、人群的不同而呈差異性分布。BRCA1突變率在不同人群中也呈現很大差異。Dillenburg等[14]報道，在歐洲的一些猶太人群體中BRCA1基因突變較高，尤以5382ins和C185delAG突變較為常見。檢測西方人群中BRCA1突變陽性乳腺癌患者的ER和PR，發現陰性率高。李鴻濤等[15]研究顯示，在維吾爾族女性乳腺癌患者所切除的癌組織活檢中，BRCA1基因的失表達率達37.9%，且維吾爾族女性BRCA1的表達陽性率明顯高于漢族。本研究結果顯示，發生基因突變的2例患者均為漢族，但統計分析結果表明，乳腺癌BRCA1基因蒙、漢族突變率的差異無統計學意義(P=0.614)；內蒙古地區TNBC BRCA1基因exon11的突變率差異無種族差異性。該結果可能受位點選擇不同、樣本量少、種族差異、地域差異及蒙古族漢化等因素的影響[16]。

綜上所述，基因檢測技術開拓了疾病病因診斷的新思路，本研究共發現2例BRCA1基因致病性突變，BRCA1突變可能參與了TNBC的發生、臨床分期和發展；統計分析得出內蒙古地區TNBC BRCA1基因exon11的突變率差異無種族差異性，但由于蒙古族乳腺癌樣本量有限，盡管平衡了引起乳腺癌的其他危險因素，但結果仍可能產生一定的偏倚，可能與樣本量小、位點選擇、民族差異、地理環境等因素相關，因此，有必要設計嚴密的大樣本、多中心研究，一方面可以提高檢出率，發現其在乳腺癌臨床診斷、分型和治療中有無應用前景。另一方面，本研究結果顯示，BRCA1基因突變均發生在三陰乳腺癌病例中，極有可能與TNBC的發生、臨床分期和發展有關，因此，有乳腺癌家族遺傳史的TNBC患者及其女性家庭成員強烈推薦進行BRCA基因突變檢測。