支鏈淀粉結構對稻米淀粉糊化特性的影響

周慧穎 彭小松 歐陽林娟 朱昌蘭 陳小榮 傅軍如 邊建民 胡麗芳 賀浩華 賀曉鵬

(江西農業大學農學院;作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室； 雙季稻現代化生產協同創新中心，南昌 330045)

直鏈淀粉含量(Amylose Content,AC)對稻米食味品質有重要影響[1-2]，而支鏈淀粉精細結構的不同是導致AC相似品種間品質差異的重要因素[3-4]。支鏈淀粉精細結構包括鏈長和鏈長分布、平均鏈長(Average Chain Length,CL)、平均外鏈長(Average exterior Chain length,ECL)、平均內鏈長(Average Internal Chain Length,ICL)、A∶B值等參數[5]。在支鏈淀粉鏈長和鏈長分布與稻米品質和淀粉理化特性關系的研究方面，胡志萍等[6]研究表明，淀粉的鏈長及支鏈淀粉長、中、短鏈的比例不同，可以使相同AC的品種可能具有不同的糊化溫度和膠稠度。賀曉鵬等[7]研究指出，支鏈淀粉不同鏈長范圍的支鏈數量比例主要與淀粉的糊化溫度相關，而與淀粉的膠稠度和RVA成糊特性關系不密切。還有報道，Vandeputte等[8]認為支鏈淀粉DP為6～9的短鏈引起糊化溫度下降；DP為12～22的鏈使得起始糊化溫度(Onset Gelatinization Temperature,To)上升；DP值為6～9和DP>25的支鏈淀粉鏈降低了支鏈淀粉終結糊化溫度(End Gelatinization temperature,Te)及糊化焓(Gelatinization Enthalpy,ΔH)。除鏈長和鏈長分布外，稻米支鏈淀粉的CL、ECL、ICL、A∶B值等結構參數的研究相對較少。

本研究選取了26個AC為11%～15%的低AC類型水稻品種，應用改進的酶法測定了支鏈淀粉的β-淀粉酶水解率、CL、ECL、ICL、A∶B值等結構參數，探討了支鏈淀粉的精細結構與稻米淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性的相關性，以明確支鏈淀粉結構對稻米品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選取26個AC為11%～15%的低AC類型水稻品種，其中秈稻品種8個，粳稻品種18個，具體見表1。各供試品種于2014年在江西農業大學實驗田作中稻種植，均按常規水肥管理，分期播種，同期收獲。水稻種子成熟后收獲曬干，用精米機充分研磨成精米后進一步磨成米粉，通過100目的篩子，充分干燥后密封保存，用于后續研究。

β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、普魯蘭酶(EC 3.2.1.41)、異淀粉酶(EC 3.2.1.68)：Sigma-Aldrich公司。

SCINO-CT410旋風式樣品磨：瑞典FOSS公司；TU-1810D紫外可見分光光度計：北京普析公司；RVA-TecMaster黏度速測儀：瑞典Perten公司；DSC4000差示掃描量熱儀：美國Perkin-Elmer公司。

1.2 支鏈淀粉精細結構的測定

利用基于β-淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶的酶法并加以優化后進行支鏈淀粉CL、ECL、ICL、A∶B值的測定[9]。

1.2.1 支鏈淀粉的分離與純化

支鏈淀粉的純化參照賀曉鵬等[7]的方法。

1.2.2 β-淀粉酶水解率的測定

稱取0.5 g純支鏈淀粉放入50 mL的離心管中，加入濃度為0.02 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖液25 mL，充分混勻后加入β-淀粉酶2 500 U，同時滴加1～2滴甲苯防止微生物生長，然后37 ℃水浴保溫反應時間48 h后，將反應液置于沸水浴中25 min滅酶，冷卻后測定體系中的總糖和總還原力，以不加酶的樣品作為對照，計算支鏈淀粉β-淀粉酶水解率：

β-淀粉酶水解率=還原力(麥芽糖當量)×100/總糖(麥芽糖當量)

1.2.3 支鏈淀粉鏈長的測定

稱取22 mg純支鏈淀粉放入5 mL離心管中，加入濃度為0.05 mol/L，pH 5.0的醋酸緩沖液5 mL，充分混勻后加入普魯蘭酶4 U，液面以1～2滴甲苯覆蓋后置于37 ℃的水浴中保溫。反應24 h后，將反應液沸水浴滅酶20 min，冷卻后利用蒽酮-硫酸法和二硝基水楊酸(DNS)法測定體系中的總糖和還原糖含量(μg/mL)，以不加酶的樣品作為對照計算CL，并計算出ECL和ICL：

CL=產物中的總糖(葡萄糖當量)/產物中的總還原力(葡萄糖當量)

ECL=CL ×β-淀粉酶水解率+2.0

ICL=(CL-ECL)-1.0

1.2.4 支鏈淀粉A∶B值的測定

將測定β-淀粉水解率時的最終反應液加入3倍體積甲醇，冰浴30 min后6 000 r/min離心5 min，傾去上清液，加入75%的甲醇沖洗沉淀，37 ℃恒溫干燥后用研缽磨成細粉，即得支鏈淀粉β-極限糊精。稱取5 mg支鏈淀粉β-極限糊精于2 mL離心管中，加入200 μL蒸餾水，沸水浴中加熱攪拌10 min。再次加入濃度為0.04 mol/mL，pH4.5的醋酸緩沖液，沸水浴中加熱攪拌10 min后冷卻至室溫，制成質量濃度為1 mg/mL的β-極限糊精溶液。以此為底物，取2 mL加入異淀粉酶100 U/mL，在37 ℃條件下振蕩反應24 h后，置沸水浴中加熱20 min滅活異淀粉酶，利用DNS法測定其還原糖含量C1(μg/mL)。繼續往反應液中加入普魯蘭酶1 U/mL，在37 ℃條件下振蕩反應24 h后，置沸水浴中加熱20 min滅活普魯蘭酶，測定其還原糖含量C2(μg/mL)，即可計算出A∶B值：

C1=B+0.5A

C2=B+A

1.3 稻米RVA成糊特性的測定

RVA成糊特性采用黏度速測儀測定，按AACC(美國谷物化學家協會)操作規程，并用TCW配套軟件進行數據分析[10]。稱取實驗樣品3.0 g放入鋁罐內，加入25 mL蒸餾水，充分混勻后，放入儀器中進行糊化。具體測定過程如下：先在50 ℃下保持1 min，然后在3.75 min內恒速升溫至95 ℃，并保持2.5 min，再以恒速在3.75 min內降溫到50 ℃，并且保持1.4 min。攪拌器在起始10 s內轉動速度為960 r/min，之后保持在160 r/min，從測定開始到結束共需12.5 min。RVA成糊特性曲線用最高黏度(PKV)、熱漿黏度(HPV)、冷膠黏度(CPV)、崩解值(BDV,PKV-HPV)、消減值(SBV,CPV-PKV)等特征值來表示，每個樣品重復測定3次。

1.4 DSC熱特性的測定

DSC熱特性用差示掃描量熱儀測定。稱取5.0 mg左右實驗樣品置于鋁盒中，并記錄其具體重量，然后加入15 μL的蒸餾水，用配套鋁蓋密封鋁盤，在室溫下平衡過夜。以只加蒸餾水的鋁盤作為參比，測定處理樣品，以10 ℃/min的升溫速率從30 ℃上升到110 ℃，得到試樣的DSC熱特性曲線。To、最高糊化溫度(Peak gelatinization temperature,Tp)、Te及糊化時的ΔH等參數在配套通用分析軟件中分析得到[11]，每個實驗樣品重復3次。

1.5 數據分析

采用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行統計分析[12]，對全部品種和AC為11%～13%及AC為13%～15%兩組的支鏈淀粉結構與RVA成糊特性及DSC熱特性的相關性進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同水稻品種支鏈淀粉結構和淀粉糊化特性

26個參試品種的支鏈淀粉結構參數和RVA成糊特性及DSC熱特性參數的測定結果見表1和表2。進一步分析參試水稻品種的支鏈淀粉精細結構參數之間的相關性(表3)發現，在支鏈淀粉結構參數之間除了ICL與CL、A∶B值間無顯著的相關性間，其他參數兩兩之間均檢測到了顯著的相關性，可見支鏈淀粉不同結構參數之間相互都有關聯。

表1 26份低AC水稻品種AC及其結構參數

表3 支鏈淀粉結構間的相關性

注：*、 ** 分別為達顯著(P<0.05)和極顯著水平(P<0.01)，下同。

2.2 支鏈淀粉結構與淀粉糊化特性參數的相關性

支鏈淀粉精細結構和淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性間的相關性見表4，由表4可知，26個水稻品種中ECL與DSC熱特性中的To、Tp呈極顯著正相關，與Te也呈顯著正相關；與RVA成糊特性中的PKV呈極顯著負相關，與SBV呈極顯著正相關，與HPV、BDV呈顯著負相關。CL與To、Tp、Te呈顯著正相關；與PKV、BDV呈極顯著負相關，與SBV呈極顯著正相關。A∶B值與To呈顯著負相關，與PKV、BDV呈顯著正相關，與SBV呈顯著負相關。ICL只與To呈顯著負相關，與其他參數間的相關性不明顯。為盡量排除AC對稻米淀粉糊化特性的影響，將參試的26個品種按AC分成11%～13%(12個品種)和13%～15%(14個品種)兩組，由表4可知，兩組材料的支鏈淀粉結構與淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性的相關性與全部26個品種間的基本一致。具體表現為，ECL在兩組材料中與To、Tp呈顯著正相關；與PKV呈顯著負相關，與SBV呈顯著正相關。CL在兩組材料中與Tp呈顯著正相關；與PKV、BDV在11%～13%分組和13%～15%分組間分別呈極顯著和顯著負相關；與SBV在11%～13%分組和13%～15%分組間分別呈極顯著和顯著正相關。A∶B值與To呈顯著負相關，與PKV、BDV呈顯著正相關，與SBV呈顯著負相關。

3 討論

支鏈淀粉作為稻米淀粉的最主要組分，是淀粉粒各級結構形成和稻米理化特性的主要決定因素，也是造成AC相同或相近的水稻品種間稻米品質差異的主要原因。現有研究表明，稻米淀粉的糊化過程，實質上就是淀粉晶體的溶解，其中涉及了淀粉體形狀的差異、淀粉體間排列的緊密程度、直鏈淀粉從淀粉體中的浸出、支鏈淀粉鏈的分子組成、淀粉晶體中支鏈淀粉雙螺旋結構的斷裂和分解等[13]。在本研究中，26個水稻品種的CL、ECL與To、Tp、Te呈正相關，A∶B值與To呈負相關，這可能是由于稻米支鏈淀粉的短鏈比例高時，由于短鏈不能最大程度地堆積到晶體片層中去，晶體化順序較差，因而To、Tp、Te低；而當支鏈淀粉中的長鏈比例高時，這些長鏈可能通過形成較長的雙螺旋結構，從而導致糊化時需要較高的溫度來解離，因而To、Tp、Te高[14-15]。同時，相對較高To、Tp、Te的稻米品種具有相對緊密的組織結構，在淀粉糊化時水分滲透、擴散到淀粉顆粒內部的能力和速度較慢，因此支鏈淀粉的長鏈所占比率越高的稻米品種在蒸煮時需要更多的水分和更長的蒸煮時間[16-17]。

近年來，RVA成糊特性與稻米品質的關系已有了一定的研究[18-21]，在本研究中，26個水稻品種的CL、ECL與PKV和BDV呈負相關，A∶B值與PKV和BDV呈正相關，這可能是由于支鏈淀粉中長鏈的比率越高，分子間的作用力就越強，抑制了淀粉的膨脹，蒸煮性變差，不利于淀粉的糊化，PKV降低；同時長鏈也使糊化過程中支鏈淀粉結構不易破裂，使淀粉顆粒結構維持在膠稠化狀態，抑制了淀粉糊液黏度的下降，從而降低了BDV，米飯質地變硬，食味品質下降[22-23]。研究還發現，CL、ECL與SBV呈正相關，而A∶B值與其呈負相關，這是由于淀粉糊化過程后期，隨著溫度的降低，米糊中的直鏈淀粉和支鏈淀粉再度進行分子間的重排，因此，支鏈淀粉中長含量越高，淀粉中的分子重新排列越容易形成恢復成有序狀態，SBV增大；而支鏈淀粉中短鏈含量越高，其分子鏈間的松散程度越高，從而減弱了淀粉分子鏈重新締合的緊密程度，SBV減小，米飯冷卻后表現出良好的抗回生能力。

表4 支鏈淀粉結構與淀粉糊化及熱特性參數間的相關性

4 結論

支鏈淀粉結構的不同是導致AC相近的水稻品種間品質差異的主要原因，淀粉的鏈長結構是影響淀粉糊化的主要因素，支鏈淀粉的CL、ECL、A∶B值對淀粉RVA成糊特性及DSC熱特性有較大影響。26個水稻品種的CL、ECL與To、Tp、Te、SBV呈正相關，與PKV和BDV呈負相關；A∶B值與PKV和BDV呈正相關，與To、SBV呈負相關，因此，低CL、ECL及高A∶B值的稻米淀粉RVA成糊特性較好、糊化溫度較低。