羊口瘡病毒F1L、B2L基因重組腺病毒構建及對小鼠的免疫效果分析

陳 曉，葛 雷，戴建軍*，李 麗，張德福，吳彩鳳，張樹山

(1.上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；. 錦州醫科大學畜牧獸醫學院，錦州 121001；3. 上海市農業遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106)

羊口瘡是以山羊和綿羊為易感動物的高度傳染性人畜共患病，近年來打破地域界限，嚴重制約畜牧業經濟發展[1]。該病由羊口瘡病毒(orf virus, ORFV)所致，為痘病毒科副痘病毒屬雙鏈線性DNA病毒[2]。ORFV編碼的許多毒力因子能夠在免疫系統中發揮其干擾宿主的能力[3]，這種免疫逃避機制促使病程反復持續，盛行局面難以控制。在感染動物中除羊外，還包括馬鹿、羚羊、麝牛、駱駝、松鼠、海豹、犬貓以及人[4]。與患病動物或其污染物接觸感染后，病毒首先侵襲上皮細胞破壞其完整性，其次迅速完成復制，最終患處會出現菜花樣增生的典型病灶[5]。通常在口唇、外陰、蹄部可見水泡和膿皰破潰后形成的結痂病變[6]，痊愈后，宿主痂皮內殘存的病毒顆粒仍保持感染力，可作為傳染源導致疾病再度復發。

目前ORFV的預防措施現仍以免疫弱毒疫苗為主，存在毒力返強的可能，且實際免疫效果并不是十分理想，因此新型疫苗的研制意義重大[7]。腺病毒載體系統作為重組腺病毒載體活疫苗應用研究的理想載體，其優勢表現在感染能力強、宿主范圍廣、免疫方式多、載體容量大、病毒滴度高、安全性和免疫性好等諸多方面[8]。本研究從前期分離的ORFV上海株中擴增F1L和B2L保護性抗原基因，構建串聯表達該雙基因的重組腺病毒，并通過小鼠免疫試驗初步評價其免疫特性，為ORFV新型疫苗的研發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、主要試劑及實驗動物

腺病毒表達系統(含CMV啟動子、T2A、P2A肽及EGFP熒光蛋白等)、大腸桿菌stbl3株、HEK-293細胞和轉染試劑Polybrene均為廣州賽業生物科技有限公司產品；ORFV-F416上海分離株、MDBK細胞、羊抗ORFV血清由本實驗室保存；限制性內切酶HindⅢ、XhoⅠ購自Thermo公司，限制性內切酶PacⅠ購自NEW ENGLAND BioLabs；Alexa Fluor 647-兔抗山羊IgG購自Jackson ImmunoResearch；Mouse IgG ELISA Kit 購自上海研生實業有限公司；6～8周齡ICR雌性小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.2 引物設計與基因擴增

F1L和B2L基因的引物信息見表1。經PCR擴增和測序，獲得ORFV-F416上海分離株的F1L和B2L基因序列。

表1 擴增F1L和B2L基因的引物序列

1.3 重組穿梭質粒與重組腺病毒的構建

F1L和B2L基因經測序比對后，與腺病毒穿梭載體pAd-CMV、T2A、P2A和EGF基因連接，轉化DH5α感受態株，提取陽性克隆，將PCR、HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確的重組質粒命名pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。PacⅠ內切酶線性化pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，與骨架質粒pAdEasy-1轉入大腸桿菌stbl3感受態株實現同源重組并提取質粒，經PCR、酶切鑒定正確的重組質粒命名pAdEasy-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。該質粒與Polybrene共轉染細胞融合度為70%～85%的HEK-293細胞，培養至細胞內可見細胞病變效應(CPE)及大范圍的熒光綠團，-80 ℃反復凍融收獲重組病毒，命名為pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。同理，制備不含ORFV目的基因的重組腺病毒pAV-CMV-EGFP為對照。

1.4 重組腺病毒MDBK細胞內擴增與滴度測定

pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP分別轉染MDBK細胞，待細胞出現CPE和綠色光團后反復凍融3次收毒，以3 000 r·min-1離心10 min取上清，并以10-1～10-10梯度稀釋病毒上清，接種于96孔板內單層MDBK細胞，每個稀釋度對應縱排8個孔，末端兩縱排為對照孔，37 ℃、5% CO2培養箱內吸附2 h后，棄上清補加5% FBS的細胞維持液，于相同條件下繼續培養5 d，按Karber 法測定病毒液效價。

1.5 重組腺病毒表達后檢測

1.5.1 重組腺病毒F1L、B2L基因檢測 使用病毒基因組試劑盒提取重組腺病毒(pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP、pAV-CMV-EGFP)DNA，PCR鑒定目的基因。

1.5.2 重組腺病毒間接免疫熒光(IFA)檢測 轉染后的MDBK細胞經固定、透化、封閉、一抗(羊抗ORFV血清)、二抗(Alexa Fluor 647-兔抗山羊IgG)孵育及清洗干燥后，熒光顯微鏡下觀察熒光生成情況。

1.6 重組腺病毒免疫小鼠及免疫效果評價

1.6.1 小鼠免疫接種 將20只ICR雌性小鼠隨機分2組，每組10只，分別在同一位置肌內注射ORFV重組腺病毒和PBS。初免后間隔2周實施二免。免疫方案見表2。各組小鼠在0～5周斷尾采血，分離所獲血清經56 ℃ 30 min滅活，-20 ℃存放備用。

表2 小鼠免疫方案

1.6.2 免疫小鼠IgG抗體水平檢測 使用小鼠IgG ELISA定量檢測試劑盒檢測免疫0～5周小鼠的IgG抗體水平。通過標準物質量濃度(800、400、200、100、50 ng·mL-1)與OD值計算標準曲線的直線回歸方程。

1.6.3 免疫小鼠MTT法測定脾淋巴細胞增殖 每組各取二免后第3周小鼠2只，頸椎脫臼處死，無菌分離脾制備小鼠脾淋巴細胞懸液。用RPMI-1640培養基調整細胞濃度為2×105·mL-1，以每孔100 μL接入96孔板內，培養孔內各加入50 μL 刀豆素(ConA 5 μg·mL-1)、50 μL滅活ORFV及50 μL RPMI-1640培養液，每孔各3個重復，另設3個空白對照孔。各孔混勻后于37 ℃、5% CO2培養箱內培養48 h，在臨結束前4 h加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)繼續培養4 h后，每孔加入100 μL Formanzan溶液，培養箱內再次孵育4 h，用酶標儀在570 nm處測定各孔的OD值。

1.6.4 小鼠攻毒試驗 2組小鼠在第5周使用ORFV-F416毒株細胞上清液(1×105.6TCID50)進行攻毒試驗，每只皮下接種500 μL，另取同期飼養的健康小鼠作為空白對照。逐日觀察小鼠的精神狀態，并記錄各組小鼠發病情況和體重。

1.7 數據的統計與分析

2 結 果

2.1 重組穿梭質粒和重組腺病毒的構建

先構建的ORFV重組腺病毒載體pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，經PCR擴增，顯示F1L(1 026 bp)、B2L(1 134 bp)、F1L-T2A-B2L(2 223 bp)基因的大小與預期符合；HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后出現35 283和2 203 bp兩條帶，表明ORFV目的基因成功插入腺病毒穿梭載體(圖1)。構建重組腺病毒質粒pAdEasy-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，經PacⅠ酶切鑒定，酶切后有約2和35 kb的片段，與預期大小符合(圖略)。

重組腺病毒質粒經轉染HEK-293細胞，出現病變效應綠色熒光，表明成功獲得重組腺病毒pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP。

2.2 重組腺病毒MDBK細胞內表達與毒力測定

pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP分別感染MDBK細胞，研究其能否在細胞中表達，結果轉染后72 h觀察到細胞圓縮、病變效應明顯，熒光顯微鏡下細胞內可見綠色光團，而對照組MDBK細胞生長良好，無CPE和熒光(圖2)。將純化后的重組腺病毒連續10倍10個梯度稀釋后，感染MDBK細胞，Karber法進行毒力計算，結果：pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的TCID50=1×10-5.375·mL-1；pAV-CMV-EGFP的TCID50=1×10-6.875·mL-1。

M. DL2000相對分子質量標準；1. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP陰性對照；2. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L基因；3. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L基因；4. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L基因；M1. DL10000 相對分子質量標準；5. HindⅢ單酶切產物；6. XhoⅠ單酶切產物；7. HindⅢ、XhoⅠ雙酶切產物M. DL2000 marker; 1. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP negative control; 2. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L gene; 3. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L gene; 4. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L gene; M1. DL10000 marker; 5. HindⅢ single digestion products; 6. XhoⅠ single digestion products; 7. HindⅢ, XhoⅠ double digestion products圖1 重組腺病毒載體的 PCR鑒定和HindⅢ、XhoⅠ酶切鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant adenovirus vector and HindⅢ, XhoⅠ digestion identification

A. 感染前MDBK細胞；B. 感染后72 h的DMBK細胞；C. 感染后熒光下MDBK細胞A. Pre-infected MDBK cells; B. DMBK cells at 72 h after infection; C. MDBK cells after infection under fluorescence圖2 重組腺病毒感染MDBK細胞Fig.2 Recombinant adenovirus infects MDBK cells

2.3 重組腺病毒表達后鑒定

2.3.1 重組腺病毒F1L、B2L基因檢測 以MDBK細胞擴增的重組腺病毒DNA為底物，用F1L上下游引物、B2L上下游引物及F1L上游引物和B2L下游引物分別擴增F1L、B2L、F1L-T2A-B2L基因，結果見圖3。pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的DNA中擴增出F1L(1 026 bp)、B2L(1 134 bp)、F1L-T2A-B2L(2 223 bp)，與預期大小一致，而pAV-CMV-EGFP無目的條帶出現。

2.3.2 重組腺病毒間接免疫熒光檢測 結果見圖4，轉染pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的細胞樣品有紅色熒光，表明與抗體發生反應，F1L、B2L蛋白有表達，而轉染pAV-CMV-EGFP的樣品并無該現象。

M. DL2000相對分子質量標準；1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L基因；2. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L基因；3. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L基因；4. pAV-CMV-EGFP F1L基因；5. pAV-CMV-EGFP B2L基因；6. pAV-CMV-EGFP F1L-T2A-B2L基因M. DL2000 marker; 1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L gene; 2. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L gene; 3. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L gene; 4. pAV-CMV-EGFP F1L gene; 5. pAV-CMV-EGFP B2L gene; 6. pAV-CMV-EGFP F1L-T2A-B2L gene圖3 重組腺病毒F1L、B2L基因PCR鑒定Fig.3 PCR amplification for identifying F1L, B2L genes of the recombinant adenovirus

A. 轉染pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP；B. 轉染pAV-CMV-EGFPA. Transfection of pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP; B. Transfection of pAV-CMV-EGFP圖4 IFA間接免疫熒光檢測Fig.4 IFA indirect immunofluorescence assay

2.4 重組腺病毒免疫效果評價

2.4.1 小鼠IgG酶聯免疫分析 IgG酶聯免疫分析結果見圖5：pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP免疫組小鼠初免第1周抗體水平明顯升高，且與PBS組差異顯著(P<0.05)，第2、3周抗體水平極顯著高于PBS組(P<0.01)，二免后第4周達到峰值——(134.13±8.01) ng·mL-1，極顯著高于PBS組(P<0.01)，第5周抗體水平開始下降，仍顯著高于PBS組(P<0.05)；PBS組小鼠抗體水平穩定無明顯波動。

與PBS組比較, **.P<0.01, *.P<0.05，下同Compared with PBS group, **.P<0.01, *.P<0.05. The same as below圖5 小鼠血清IgG含量測定Fig.5 Determination of serum IgG in mice

2.4.2 小鼠T淋巴細胞增殖結果 小鼠脾淋巴細胞經非特異性刺激(ConA)、特異性刺激(滅活ORFV)和無刺激(RPMI-1640)處理后，淋巴細胞增殖情況如圖6所示。ConA刺激后，ORFV重組腺病毒組OD值高于PBS組，但兩者之間均無顯著差異(P>0.05)；ORFV重組腺病毒組對特異性抗原ORFV表現出明顯的T淋巴細胞增殖能力，其OD值極顯著高于PBS組(P<0.01)；無刺激組顯示，ORFV重組腺病毒組OD值極顯著高于PBS組(P<0.01)。ORFV重組腺病毒組在3種處理下脾淋巴細胞均出現增殖現象。

1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP; 2. PBS圖6 小鼠脾淋巴細胞增殖試驗Fig.6 Spleen lymphocyte proliferation test in mice

2.4.3 小鼠攻毒保護效力 小鼠攻毒后第9～11天，PBS和pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP兩組剩余的8只小鼠中分別有4只(50%)、1只(12.5%)小鼠出現精神沉郁、弓背，攻毒部位可見皮毛松亂，有啃咬現象。攻毒后6～8周內PBS組小鼠體重明顯降低，整體采食量減少； pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP組小鼠體重逐漸增加，接近空白對照組；而未攻毒組小鼠體重值趨于穩定，說明ORFV重組腺病毒呈現一定的保護效果，見圖7。

3 討 論

羊口瘡作為一種病毒性傳染病已呈現全球性暴發，毒株的類型日新月異，易感物種日益擴增，活病毒逃逸且尚無特效藥物治愈，這些現象致使病程持續蔓延，嚴重牽制著世界各地養羊業規?；难杆倭己冒l展。腺病毒基因表達載體其基因組能夠承載多種異源基因，對靜止和分裂期細胞均可轉染，目前廣泛用于基因疫苗的研究[9]，在人和動物的腺病毒載體構建及臨床應用上均有成功的案例[10-13]。ORFV的F1L和B2L基因是兩個重要的保護性抗原基因，其中F1L蛋白可介導細胞免疫，引起機體產生免疫反應，被認為是羊口瘡亞單位疫苗研制的標準抗原[14]；B2L蛋白則可刺激機體產生抗體反應，促使淋巴細胞增殖[15]。盡管ORFV以細胞免疫為主，而體液免疫水平相對較低，但因該兩種蛋白具有較好的免疫原性，本研究將F1L、B2L兩基因串聯，構建ORFV雙基因重組腺病毒載體，以期對動物機體產生更好的免疫保護作用。

本研究成功包裝出ORFV重組腺病毒，可根據綠色熒光蛋白基因在轉染細胞中是否產生綠色熒光進行鑒定篩選。獲得pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP重組腺病毒并感染MDBK細胞，經PCR、IFA檢測，結果表明，該重組腺病毒能夠穩定攜帶F1L、B2L基因。毒力測定結果顯示，空載體pAV-CMV-EGFP的滴度(TCID50=1×10-6.875·mL-1)遠高于pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的滴度(TCID50=1×10-5.375·mL-1)，可能由于羊口瘡病毒重組腺病毒導入的外源基因(F1L、B2L、T2A、P2A)較多，進而對腺病毒的繁殖速度有所影響。這與楊玉艾等[16]研究的豬瘟病毒E0、E2基因構建的重組腺病毒rAd-E0-E2滴度低于其空載體rAd-CMV滴度的結果相一致。

在免疫策略上研究證明，初次免疫后再次加強免疫方式可全面激發體液免疫和細胞免疫應答水平[17-18]。本研究采用相同免疫方式免疫ICR小鼠，ORFV重組腺病毒組IgG OD值明顯高于PBS對照組，由此可見ORFV重組腺病毒可快速刺激機體產生抗體，說明所構建的羊口瘡病毒重組腺病毒能夠迅速刺激小鼠機體產生體液免疫應答。此外，小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結果顯示，ORFV重組腺病毒免疫小鼠對細胞免疫應答水平也有所促進，它對特異性抗原ORFV和非特異性ConA蛋白抗原的刺激均可誘導T淋巴細胞增殖，但對非特異性抗原刺激表現的增殖能力較強，符合趙魁[19]的試驗結果，這表明經pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP免疫后，小鼠的免疫系統在一定程度上處于高活化狀態。

以小鼠攻毒試驗對所構建的羊口瘡病毒重組腺病毒進行安全性和效果評價，ORFV重組腺病毒免疫組小鼠體重趨于穩定，在ORFV攻毒后體重仍呈上升趨勢，接近于未攻毒組，說明該免疫組并未影響小鼠整體正常采食生長狀況，僅有1只小鼠攻毒后精神狀態不佳，結果提示能夠提供一定的安全免疫保護作用。但本研究中，各免疫組小鼠在攻毒部位均未見特征性結痂病變及死亡情況，這可能與小鼠品系、病原毒性、攻毒劑量等因素相關。另外，腺病毒大劑量使用通常會引起嚴重的免疫反應[20]，甚至引發組織損傷[21]，因而免疫方法、免疫劑量、疫苗的種類及抗原蛋白表達水平都有待于進一步優化和研究。

4 結 論

成功構建ORFV的F1L、B2L基因串聯表達的重組腺病毒，免疫小鼠后能夠刺激小鼠產生體液免疫和細胞免疫應答，且未影響小鼠正常采食，保護效力較好。該研究可為ORFV DNA疫苗的研制提供應用和理論依據。