應用功能微生物菌劑提高醬香白酒窖面酒質量的研究

盧 君，山其木格，王 麗，孟天毅，張忠奎，李長文，

（1.天士力控股集團有限公司研究院，天津300410；2.貴州國臺酒業有限公司，貴州仁懷564501）

醬香型白酒以其感官風味特征的豐富性，深受消費者的喜愛。醬香型白酒“三高三長”的工藝，即高溫制曲、高溫堆積發酵、高溫餾酒、基酒生產周期長、基酒酒齡時間長、大曲儲存時間長，以及參與其中的微生物菌群的作用，決定了醬香白酒物質組成的復雜性和感官風格的豐富性[1]。

醬香型白酒生產過程中主要有3種典型體的基酒，分別為窖面酒、窖底酒和醇甜酒[2]。窖面酒醬香突出、曲香明顯、略澀、后味綿長；醇甜酒醬香突出，具有醇甜味，后味爽凈；窖底酒具有部分濃香型酒風格，醬香明顯，濃厚豐滿[3]。其中窖面酒主要體現醬香和曲香的風格，對于醬香白酒主體香的呈現起到了至關重要的作用。因此，各大醬香型白酒企業對于窖面酒的生產都格外重視。

“曲乃酒之骨”，大曲的品質對于窖面酒來說更加重要，因為在窖面糟醅培植的過程中使用了更多的曲粉，目的是生產出窖面風格突出的窖面酒。大量研究表明，關于醬香型白酒高溫大曲中能產醬香風味的微生物大多是芽孢桿菌屬。由于芽孢桿菌生長代謝的作用，促進了美拉德反應產生大量醬香物質[4-5]。

隨著微生物技術的發展，近年來越來越多的釀酒企業重視利用微生物菌劑來提升產質量，取得了一些成果。例如趙希玉等從茅臺酒釀造微生物分離得到6株產醬香芽孢桿菌屬，將其制成細菌曲后，可生成香草醛、阿魏酸、丁香酸等組成醬香型白酒的香味物質，有助于提高或補充大曲醬香型白酒中的香氣物質成分[6]。顏林春等[7]從醬香型高溫大曲中篩選到10株芽孢桿菌功能菌，經純種液體培養后加入制曲原料制成強化高溫大曲，強化高溫大曲符合酒廠一級大曲質量指標，并且強化大曲中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量明顯高于普通大曲。

本研究計劃從“國臺酒-細菌菌種庫”中篩選出功能芽孢桿菌屬的菌株，進而利用這些菌株制作菌劑，強化到窖面糟醅的培植過程中，研究其代謝產香能力，評判窖面酒質量是否提高，初步探索決定窖面酒質量的物質成因，最終確定功能菌株和強化工藝，用以提高窖面酒的質量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：“國臺酒-細菌菌種庫”中保藏的芽孢桿菌屬的菌株，包含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、耐熱芽孢桿菌、索諾拉沙漠芽孢桿菌在內的5個種，共計18株菌。

材料：小麥，酒廠提供。

試劑：氯化鈉，分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司；乙醚，分析純，天津威晨化學試劑科貿有限公司；蛋白胨、酵母浸粉，生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；2-乙基丁酸，色譜純，天津市光復精細化工研究所。

儀器設備：生化培養箱，德國Binder公司；Thermo GC-MS Trace 1300氣相色譜質譜聯用儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；色譜柱（HPFFAP，30 m×0.53 mm，1 μm），美國安捷倫公司；電熱鼓風干燥箱，天津市天宇實驗儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海森信實驗儀器有限公司；立式滅菌器，山東新華醫療器械股份有限公司；磁力攪拌器，天津布斯特科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 功能微生物篩選和菌劑制作

（1）LB培養基的配制：蛋白胨10 g，酵母浸出汁5 g，NaCl 10 g，水1000 mL，調pH7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

（2）一級種子培養：從篩選得到的芽孢桿菌斜面挑取少許菌體，轉接至250 mL三角瓶，每個瓶中裝有50 mL的LB液體培養基。搖床37℃，200 r/min條件下培養至生長穩定期。

（3）二級種子培養：將篩選得到的芽孢桿菌培養液50 mL一分為二，分別轉接至1000 mL大三角瓶，內裝有250 mL LB液體培養基，即接種量為10%，37℃，180 r/min條件下培養至生長穩定期。

（4）固體菌劑培養：稱取22.5 kg小麥潤糧（8%加水量，熱水）3 h，然后進行磨碎和裝盆。每個不銹鋼盆中裝入的磨碎小麥量為2.6 kg，加入800 mL水（補水量即31%）。分別將篩選出的芽孢桿菌的二級種子培養液轉接到對應的不銹鋼盆中，不銹鋼盆上覆蓋紗布和塑料袋，進行固體培養。步驟為：第1天在培養箱中37℃培養24 h；第2天將培養溫度調整至45℃，持續2 d；發酵第4天進行翻拌，持續3 d；第7天將培養溫度調整至52℃；第8天將培養溫度調整至57℃；第9天將培養溫度調整至62℃。發酵過程中觀察發酵情況，第10天或11天時大致完成菌劑培養。

（5）感官評價和菌株篩選：在結束菌劑培養之后，將菌劑磨成粉，然后利用五分制打分法進行感官初評和復評，從以下感官特征進行評價，共分為6類：醬香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。篩選出醬香強度大，且整體風格明顯的樣品，挑選其為出發菌株，作為生產應用菌株。同時，檢測篩選出的菌株的酸度、糖化力、中性蛋白酶活力和酸性蛋白酶活力指標。

（6）菌劑生產應用：將篩選出的功能芽孢桿菌制作的菌劑等比例混合后應用于2017年貴州國臺酒業三輪次窖面酒的生產中，選取了一車間2班6號窖池和二車間10班6號窖池為試驗窖池，其他窖池均為對照窖池。應用功能芽孢桿菌制作的固態菌劑（等比例混合）（共10 kg）培植窖面糟醅，菌劑與普通曲粉的混合比例為1∶5，跟蹤發酵生產進程，評定窖面酒質量的差異。

1.2.2 測定及數據分析方法

（1）理化指標檢測方法

糟醅酸度、還原糖和淀粉含量：酸度測定采用酸堿滴定法、糖分和淀粉含量采用斐林滴定法，具體檢測方法參見沈怡方編著的《白酒生產技術全書》[8]。

酒精度、總酯、總酸：參照GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[9]。

蛋白酶活力檢測：Folin法[10-11]。（2）揮發性物質檢測方法

Ⅱ菌劑揮發性物質組成檢測采用頂空固相微萃取結合氣質聯用儀（SPMEGC-MS）的方法，具體檢測條件為：

A.樣品前處理方法

稱取5 g粉碎后的大曲樣品，置于20 mL頂空瓶內，加入5 mL飽和NaCl溶液、50 μL內標溶液（2-乙基丁酸），放入磁力攪拌轉子，輕輕搖勻。置于50℃水浴中平衡10 min，插入50/30 μm萃取頭攪拌吸附30 min，最后于進樣口處解吸5 min。

B.儀器檢測條件

GC條件：進樣口溫度250℃，載氣He，柱流速1.5mL/min，吹掃流量：1.0mL/min，總流量25mL/min，分流比10∶1；色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升溫程序：40℃保持2 min，以3.5℃/min升溫至90℃，以5℃/min升溫至230℃保持10 min。溶劑延遲0.1 min。

MS條件：電子電離源(EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃；全掃描模式。

Ⅱ基酒揮發性物質組成檢測

A.樣品前處理方法

取5 mL白酒樣品，15 mL超純水，50 μL GCMS內標溶液（2-乙基丁酸），混勻，然后加入2.0 mg的NaCl，2 mL的乙醚，渦旋振蕩至NaCl完全溶解；靜止20 min后，取上層作為供試品。

B.儀器檢測條件

GC條件：進樣口溫度250℃，載氣He，柱流速1.5mL/min，吹掃流量：1.0mL/min，總流量25mL/min，分流比10∶1；色譜柱：HP-FFAP（50 m×0.25 mm，0.2 μm）；升溫程序：40 ℃保持2 min，以3.5 ℃/min升溫至90℃，以5℃/min升溫至230℃保持10 min。溶劑延遲0.1 min。

MS條件：電子電離源(EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度250℃；全掃描模式。

（3）數據分析方法

GC-MS數據通過AMDIS軟件導出，各個窖面酒樣GC-MS總離子流圖中出峰物質的相對峰強度為出峰物質的峰面積比上內標物2-乙基丁酸的出峰面積。不同酒樣之間的差異性分析采用SIMCA 11.5軟件進行PLS-DA模型分析，尋找解釋窖面酒質量差異成因的物質組分（VIP得分大于1.2）。

2 結果與分析

2.1 功能微生物篩選結果

對18株待測芽孢桿菌菌株進行固態發酵培養之后，將得到的菌劑磨成粉，然后由3名具有多年生產經驗的人員進行感官初評和復評，通過打分法，從以下感官特征對菌劑進行評價，共分為6類：醬香味、酸味、焦香味、氨臭味、糊味和咸腥味。篩選出醬香強度大，且整體風格明顯的樣品，挑選其為出發菌株，作為生產應用功能菌株。18株出發菌株對應的菌劑感官得分結果見圖1。

圖1 功能菌株篩選——感官數據雷達圖

由圖1可知，在18株菌株中，A29、A27、B12和M2這4株菌株其發酵產物在醬香和整體風格兩項感官特征打分最高，香氣特征最明顯。考慮到目前尚沒有評價窖面酒的質量高低的理化或物質成分指標，所以，本研究采用感官評價的方法篩選出可能提高窖面酒質量的功能菌株，繼而再進行生產驗證。

A29、A27、B12和M2這4株菌株表現出了更為突出的感官特征，進而我們考察了這4株功能菌株的理化指標性能，結果見表1。

由表1可知，篩選出的4株功能菌株，其理化特征數據并不突出，糖化力很低，蛋白酶的活性也不高。有些研究報道稱“產醬香功能菌”，一般代謝產蛋白酶的活力也較高[4，5，12]，而本研究中的功能菌株表現為蛋白酶活力不高，但醬香特征非常明顯。因此，我們認為不是所有的“產醬香功能菌”都具有較高蛋白酶活性。另外，也可能是本研究模擬大曲高溫發酵的固態發酵方式，蛋白酶在高溫階段活力降低的原因。

由于篩選出的這4株功能菌株，醬香特征和整體風格特征明顯，本研究考察了4株功能菌株對應的菌劑的揮發性物質成分情況。結果表明，揮發性物質中含量較多的物質分別為四甲基吡嗪、丁酸、2,6-雙（1,1-二甲基乙基）-4-羥基-4-甲基-2,5-環己二烯-1-酮、苯甲醛、乙偶姻和3-甲基丁酸。A27、M2、B12這3株菌株代謝產四甲基吡嗪的能力非常強，均占到各自發酵菌劑中所有代謝產物的45%以上。其中，M2代謝產四甲基吡嗪能力最強，達到了所有代謝產物的84%。此結果初步說明，四甲基吡嗪是決定菌劑的醬香特征和整體風格的重要物質之一，與以往的文獻報道一致[13-15]。功能菌株揮發性物質代謝結果見圖2。

表1 功能菌株理化指標結果

圖2 功能菌株揮發性物質代謝結果

表2 試驗窖窖面培植的生產工藝原始記錄

2.2 功能微生物菌劑的生產應用

將篩選出的4株功能芽孢桿菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌劑等比例混合后應用于2017年酒業窖面酒的二輪次生產中，選取一車間2班6號窖池和二車間10班6號窖池為試驗窖池；再選取一車間2班6個其他窖池作為對照窖池；二車間10班6個其他窖池作為對照窖池。應用該4株產醬香微生物制作的固態菌劑（等比例混合）（共10 kg）培植窖面，等量替代原生產曲粉，即實驗窖池采用10 kg微生物菌劑和50 kg普通曲粉，混入窖面糟醅中，跟蹤發酵生產進程。對照窖培植窖面時完全采用普通曲粉（60 kg）。二輪次試驗窖窖面培植的現場生產及其生產工藝原始記錄見表2。

在實驗過程中，我們跟蹤了實驗窖池和對照窖池在生產發酵過程中糟醅的理化指標的變化，即跟蹤了入窖糟醅和出窖糟醅的酸度、糖分、水分和淀粉含量的變化。結果表明，添加了微生物菌劑的實驗窖糟醅理化指標與對照窖糟醅的理化指標非常接近，由于數據較多，本文未展示。檢測結果說明通過人工強化微生物菌劑的方式，雖然改變了發酵前初始微生物種群的組成，但是在發酵結束后，并不會影響發酵指標的變化，我們推測，強化的微生物菌劑是改變了醬香風味物質或前體物質含量，進一步影響了窖面酒的感官質量。

在發酵結束后，本研究重點關注了實驗窖池和對照窖池生產的窖面酒質量的差異，首先對比了總酸、總酯及酸酯比的情況，結果見表3。

由表3能夠看出，添加了微生物菌劑的實驗窖窖面酒與利用普通曲粉生產的對照窖窖面酒樣，在總酸、總酯和酸酯比這些指標上非常接近。進一步說明了微生物菌劑在發酵過程中的作用是改變了窖面酒中的微量代謝物質的含量，而不是總酸和總酯這些骨架類物質的含量。

表3 窖面酒理化指標結果

本研究對實驗窖窖面酒和對照窖窖面酒，共計14個酒樣的質量進行感官評定，利用打分法進行感官初評和復評，感官評價的結果見表4。

由表4能夠看出，實驗窖窖面酒（JM-3-2-6和JM-3-10-6）的感官得分要明顯高于對照窖窖面酒的感官得分，主要體現在曲香特征和整體風格特征上的得分高。說明添加了微生物菌劑能夠有效提高這兩種感官特征。以上結果表明，在醬香型白酒窖面酒的生產過程中，應用4株強化功能芽孢桿菌菌株A27、A29、M2、B12制作的菌劑，能夠有效提高窖面酒的質量。

本研究更關心的是哪些微量物質決定了窖面酒質量的差異，現有文獻報道均未見這方面的研究成果。因此，我們對生產出來的實驗窖窖面酒和對照窖窖面酒進行了揮發性微量物質成分的檢測。不同酒樣之間的差異性分析采用SIM-CA 11.5軟件進行PLS-DA模型分析，尋找解釋窖面酒質量差異成因的物質組分（VIP得分大于1.2），見圖3。

由圖3能夠清楚的看出，利用PLS-DA模型分析，能夠將質量不同的窖面酒進行分類。圖3中黑色（以class 1表示）的樣品代表感官得分較高的酒樣，得分都在67分以上；而圖3中紅色（以class 2表示）的樣品代表感官得分較低的酒樣，基本都低于67分。VIP得分大于1.2的物質有：2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、異戊醇、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。以上這15種物質可能是決定窖面酒質量差異的關鍵因子，但目前的數據樣本還比較少，需要未來在大量數據分析的基礎上，結合多元統計的方法，進一步確定哪些物質組分是關鍵因子，從而指導生產或勾兌。

表4 窖面酒感官評分結果

圖3 不同質量窖面酒偏最小二乘法判別分析

在以上基礎上，我們確定了利用微生物菌劑提高醬香白酒窖面酒質量的工藝流程，見圖4。

圖4 強化窖面菌劑工藝流程圖

3 結論

本研究根據發酵產物感官情況篩選出了4株功能芽孢桿菌菌株，并將這4株菌株制作成了微生物菌劑，在窖面酒生產過程中實際應用。結果表明添加了微生物菌劑的實驗窖窖面酒與利用普通曲粉生產的對照窖窖面酒樣，在總酸、總酯和酸酯比指標上非常接近。品酒結果顯示，實驗窖窖面酒的感官得分要明顯高于對照窖窖面酒的感官得分，主要體現在曲香特征和整體風格特征上。通過對窖面酒樣的揮發性物質成分分析，以及數據統計分析，初步確定了決定窖面酒質量差異成因的物質組分為2-丁酮、硬脂酸乙酯、十四碳烯酸乙酯、丙酸乙酯、2-甲基-1-丙醇、苯甲醛、1-己醇、十七烷酸乙酯、2-庚酮、正丙醇、異戊醇、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、2-甲基丙酸和月桂酸乙酯。最終，本研究確定了利用微生物菌劑提高醬香白酒窖面酒質量的工藝流程。