中藥復方功效物質基礎的研究思路與方法＊

劉建勛，孫明謙，任鈞國，林 力

（中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所 北京中藥藥理重點實驗室 北京 100091）

1 前言

中藥復方是中醫治病的主要形式，是按一定的組方原則，選擇適宜的藥味及劑量配伍而成。中藥復方功效是在傳統中醫理論的基礎上對中藥臨床作用的系統總結，代表了復方的整體效應，該效應是多種特定化學成分在特定病理條件下對機體發生作用，進行調整和整合后的生物效應表達，而這些化學成分就是中藥復方功效的物質基礎。現代研究表明中藥復方功效具有多靶點、多效應、多機制的作用特點。這主要是由于中藥復方的化學成分種類和數量的多樣性，形成了一個復雜的化學成分體系。隨著中藥化學成分分離、鑒定等新技術的發展，中藥復方化學成分在體內、體外的研究取得了極大的進展，青蒿素獲得諾貝爾醫學或生理學獎則是中藥化學成分研究的最好代表。但是，千百年來，在中醫理論的指導下，中藥復方廣泛用于中醫臨床，療效確切。因此，以中藥復方為研究對象，如何研究并確證中藥復方功效的物質基礎是目前中藥復方研究亟待解決的關鍵科學問題。

2 中藥復方功效物質基礎研究的思路

目前，中藥復方功效物質基礎的研究較少，多是進行中藥復方藥效成分或有效成分的研究，主要是在中藥化學成分分離的基礎上或采用活性追蹤的方法，采用單一的藥效評價指標進行篩選、確證。由于中藥復方復雜的物質基礎必然導致藥物效應的復雜性，因此單純的藥效評價方法難以體現中醫臨床辨證論治、病證結合、方證相應的用藥特點[1,2]。因此中藥復方功效物質基礎的研究既要保持傳統中藥的特色，又要結合現代的科學技術手段，對中藥的活性成分和作用機制進行闡明，從而研發出適合臨床治療且機理明確的藥物。為此，我們在已建立的中藥復方功效現代研究與評價體系的基礎上（獲得2014年國家科學技術進步獎二等獎），提出了中藥復方功效物質基礎研究的新思路。即將中醫臨床證候的診斷標準、療效評價技術與方法應用于中藥復方功效的研究，在明確中藥復方功效現代藥理學內涵后，以中醫藥理論為指導，結合中藥藥理、中藥化學、中藥代謝、生物系信息學等多種現代科學技術，開展中藥復方功效與化學成分之間的相關性研究，通過中藥復方功效評價，中藥復方指征物質基礎研究，構建中藥復方功效物質基礎的研究與評價體系，闡釋中藥復方功效的物質基礎及作用機理[3-4]（見圖1）。

圖1 中藥復方功效物質基礎的研究方法

3 建立中藥復方功效的評價技術指標體系

中藥復方功效評價的主要難點是如何在中醫理論的指導下對中藥復方的功能主治進行評價，并與中藥藥效的評價實現有機的整合。因此我們提出源于中醫臨床的中藥復方功效學研究思路與方法，簡單講就是采用擬臨床的研究思路制備符合中醫臨床病證特征的動物模型，建立動物模型的中醫證候評價技術與方法；開展中藥復方整體、細胞、分子等多層次的藥效學評價；建立反映中藥復方功效的中藥藥效評價技術指標體系。進而開展中藥復方功效指征物質基礎研究。本文以氣虛血瘀證為例，闡釋益氣活血功效的藥效評價技術指標體系的建立（見圖2）[7]。

3.1 建立氣虛血瘀證病證結合動物模型及其評價技術指標體系

根據冠心病氣虛血瘀證的中醫診斷標準，我們從觀察目的、研究過程和方法手段三個方面進行了重新的頂層設計，對冠心病、腦梗塞氣虛血瘀證進行了前瞻性臨床研究，獲得了病證相關的診斷指標，結合現代研究結果，發現血管內皮細胞作為一個功能復雜、代謝活躍的血管內分泌器官，其結構的損傷及由此引發的內分泌功能紊亂是導致氣虛血瘀證病理生理異常的根本原因，表現在表達和分泌血管活性物質、凝血、抗凝及纖溶等物質異常。依此，我們采用球囊拉傷冠脈血管內皮，引發白細胞粘附、血小板聚集、動脈粥樣硬化、血栓形成、組織缺血，制備了與臨床接近的慢性小型豬冠心病氣虛血瘀證模型[8]。另外，我們考慮到臨床氣虛血瘀證形成的因素，通過體勞、神勞以及復合因素的刺激，建立了冠心病及腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型[9]。將中醫臨床辯證即主癥、兼癥、舌象、脈象在內的四診信息用于動物模型證候的研究，并進行客觀化分級評分，如大鼠心功能、代表主癥；空場實驗相關指標、力竭運動時間代表兼癥；舌面色彩飽和度代表舌象；脈搏搏動幅度代表脈象。建立了氣虛血瘀證動物證候評價的新方法，同時采用系統生物學、分子生物學等技術和方法，對氣虛血瘀證模型動物的分子變化進行評價，建立氣虛血瘀證的系統評價技術指標體系，為中藥復方功效的物質基礎研究提供合適的評價模型。對腦鈉肽、內皮素、血液黏度、凝血功能等指標進行檢測。與臨床病因學以及與中醫相關理論體系的聯系更密切，在完整體現中醫證候的特征方面具有一定的優勢，更符合臨床。

3.2 建立擬臨床的氣虛血瘀相關細胞模型及其評價技術指標體系

根據氣虛血瘀證動物模型的研究結果，結合氣虛血瘀證的病理生理學基礎研究，模擬整體，在細胞水平上我們提出證候細胞模型的概念，即與臨床或整體證候模型病理生理學相近的細胞模型。如氣虛為心腦血管疾病的臨床常見證型之一，心肌細胞是心功能的主要結構單位；神經元是腦功能的主要結構單位，心肌細胞和神經元的缺血缺氧性損傷是氣虛的病理基礎之一，心肌細胞缺血造成心功能的損害及神經元的缺血造成的腦組織功能障礙主要是由于氧糖剝奪導致的細胞能量代謝障礙，而缺血再灌注更加重了細胞能量代謝障礙。因此，我們采用培養心肌細胞及神經元氧糖剝奪/復氧的方法建立氣虛細胞模型，研究發現：心肌細胞或神經元氧糖剝奪損傷后，上清液中乳酸脫氫酶（LDH）含量大量增加，ATP含量下降，提示了心肌細胞或神經元壞死，以及細胞能量代謝障礙，胞內ATP合成不足，是產生氣虛證的細胞生物學基礎，ATP減少使得代謝終產物在胞漿中積聚，能量代謝的關鍵酶的活性降低，葡萄糖、脂肪酸等攝取受到抑制，大部分代謝終產物沉積，形成“血瘀”的物質基礎。證候細胞模型及評價指標體系的建立為在細胞水平進行中藥復方物質基礎的研究與確證提供了適合的細胞模型。

4 建立中藥復方功效指征物質基礎的研究方法

中藥復方是依靠其物質基礎發揮作用的，同時由于中藥復方化學成分眾多，所以其功效物質基礎的研究也是難點問題。但要實現中藥復方新藥研發的現代化，物質基礎又是必然要求，這也是中藥實現高水平的質量控制和明確的作用機理的基礎。中藥復方可能含有成百上千種成分，且大部分含量不高，結構不明，把它們都研究清楚是不可能的。為此我們提出“中藥指征成分”的概念，化繁為簡，將中藥中其關鍵作用的代表性成分，作為中藥的指征成分，通過這些關鍵成分研究，實現對中藥物質基礎的表征，進而對中藥的功效進行闡釋[10]。在前期建立的中藥復方功效評價體系的基礎上，實現對中藥復方的物質基礎研究與病證動物模型相結合，與特定功效相結合，進而挖掘在體內發揮作用的化學成分。以動態的觀點結合中藥復方具體的應用環境來認識其功效成分。凡是能治療中醫的“證”或西醫的“病”的化學成分就是中藥復方作用的物質基礎。這種物質基礎分別由代表不同藥理指標的化學成分所指征，整合、分析藥理作用與指征成分的對應關系，深入探討與生物效應密切相關的指征成分體內過程和作用機理，即有可能闡釋中藥復方的功效及其物質基礎。這種思路的特點與優勢是省略了中藥復方有效成分非常困難的體內外篩選，而直接對與生物效應有關的指征成分進行解析。具體通過結合臨床特點，建立相應動物模型，通過PK-PD相關性研究方法，確定中藥復方指征藥效成分，在此基礎上通過對指征藥效成分的體內過程、配伍關系及交互影響、藥理作用及作用通路和靶點的研究，以闡釋中藥復方發揮功效的物質基礎及其作用機理[11,12]。

以雙參通冠方為例，首先通過定性定量分析獲得雙參通冠方的20種吸收入血藥物成分譜。然后測定了雙參通冠與心肌缺血模型動物后的血壓、心率、左室內壓、心肌收縮力、外周阻力、冠脈血流量、心肌耗氧量、心肌缺血程度及范圍等24個藥效指標在13個觀測時間點的實時數據，根據中醫基礎理論和中藥復方特點，建立了基于穩健變換、基線漂移處理、有效性判斷和差值分析等分析方法和數學模型，較好的解決了中藥多成分、多藥效指標相關性分析的關鍵科學問題。結果確定了雙參通冠方中人參皂苷Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2/3、Rf、脫氫紫堇堿、四氫巴馬汀、小檗堿，丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸12個指征藥效成分[10]。

5 中藥功效物質基礎闡釋及作用機理研究

通過建立中藥復方功效的評價體系和指征物質基礎的研究方法，為中藥復方物質基礎的深入研究提供了有效的技術保證和明確的研究對象。聚焦到復方中關鍵的活性指征成分，對其功效進行評價，可以對中藥復方的作用機理進行明確的闡釋，從而實現中藥復方新藥研發中的質量可控，療效確切，機理明確。由于這一評價體系源于臨床，以中醫理論為指導，實驗結果也可以反證該理論的科學性以及該動物模型的可靠性。以益氣活血方藥雙參通冠膠囊（人參、丹參、延胡索三種提取物配伍）為例，闡釋其物質基礎和作用機理的研究方法（見圖2）。

研究證實該雙參通冠方具有抗心肌缺血、增加冠脈血流量、降低冠脈阻力、降低心肌耗氧量，增加心功能、抗血栓形成、改善血液流變性、抗心律失常、抗氧化等作用。首先根據這些藥效，對雙參通冠方中的指征活性成分對相關藥效指標的調節作用進行研究[13]。該復方的指征藥效成分主要有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、丹酚酸A、迭迷香酸、延胡索乙素、脫氫紫堇堿、鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀等，系統歸納不同指征成分的藥效特點，作為中藥功效物質基礎重要組成部分[14,15]。同時結合中醫理論，根據“氣虛于脈而血瘀，血阻于脈則氣虛”的觀點，進行在體實驗的觀察，給與雙參寧心膠囊治療8周后，氣虛血瘀證冠心病小型豬的冠脈管腔狹窄得到改善，可重新見到造影劑的充盈，管腔直徑有所增加，內皮細胞內分泌功能也得到恢復，表現在內皮素含量下降，NO含量增加。益氣活血藥的血管調節作用反過來帶來“氣虛血瘀”癥狀的改善，由管腔狹窄造成心肌細胞喪失減少，抑制了心肌細胞自噬的發生，血流動力學的恢復，增加左心做功能力，改善心肌細胞代謝，使氣虛證得到緩解；雙參寧心膠囊還可降低慢性睡眠剝奪建立的氣虛血瘀證大鼠的全血粘度以及血漿粘度，這體現了“血瘀”證的緩解。在整體動物模型動物研究的基礎上再應用氣虛血瘀相關細胞模型對雙參通冠方中的指征成分進行研究。以活血藥丹參的有效成分丹酚酸B為代表，從自噬調節及促進血管新生兩個角度，反證了根據“氣虛于脈而血瘀”施以益氣活血治療的有效性。根據“饑則損氣”的理論，我們繼續進行了離體實驗的觀察，用細胞饑餓法造成心肌細胞“氣虛”狀態，給予丹酚酸B治療后，大量聚集在細胞漿內的LC3-II熒光強度顯著下降，提示了自噬在一定程度上被丹酚酸B所抑制，伴隨自噬抑制同時發生改變還有細胞活性及能量ATP的恢復，提示益氣活血成分丹酚酸B可限制氣虛的發生；同時，從“脈”入手，發現丹酚酸還可促進內皮祖細胞的增殖，增強其遷移及粘附

能力，活血成分阿魏酸可促進體外血管內皮細胞的增殖；利用雞胚絨毛尿囊膜實驗，證實了丹酚酸可增加體外新生血管的密度，促進了缺血區域的血管新生，改善缺血區的血供情況，逆轉“氣虛”程度的發展。圖3為雙參通冠膠囊的藥理作用與機制。

圖2 氣血血瘀證的研究與評價方法

圖3 雙參通冠方的物質基礎與作用機理

此外，應用中藥復方指征成分的有效性研究方法，還可以對中藥復方的配伍機制進行研究。通過正交設計確定復方中藥物的最佳劑量配伍，然后比較配伍組方與各組成成分對藥效指標的影響，分析比較其藥理作用和各成分變化之間的相關性，從而明確中藥復方發揮功效的有效成分配伍機制。如應用乳鼠心肌細胞缺氧復氧損傷模型選擇經過數據處理得到有效成分的最佳組方為迷迭香酸、脫氫紫堇堿、丹酚酸A和延胡索乙素，同時發現有效成分之間具有一定的交互影響；在整體的配伍機制研究中通過七種不同配伍方式下大鼠血漿中主要有效成分的藥代參數的分析，闡釋了雙參通冠方配伍的藥代機制[5]。

6 總結與展望

構建中藥復方功效物質基礎的研究與評價體系，一直是多年來中醫藥現代化研究的重點。中藥復方功效的現代科學研究是一個的系統工程，需要多學科的相互融合，中西醫的相互融合，傳統中醫理論與現代科學技術的相互融合。其研究既需要體現中醫臨床與理論的特點，又要對療效、機制進行明確的科學驗證與闡釋。中藥復方功效物質基礎的研究體系的構建不僅有利對闡明傳統中醫理論科學內涵，同時也為中藥新藥的研發提供了更為先進的平臺，有利實現中藥療效評價的明確、活性成分的明確、作用機制的明確。雖然中藥系統復雜，但其功效物質基礎的研究日益受到關注，越來越多先進的技術手段如系統生物學、生物信息學，網絡藥理學等應用于該領域的研究中，也會隨之產生更多新思路、新理論、新方法，從而促進中醫藥現代研究的發展。