基于整合藥理學平臺探究滋補脾陰方藥防治輕度認知功能障礙的物質基礎與作用機制＊

周 雯，戰麗彬,2＊＊

（1.南京中醫藥大學基礎醫學院 南京 210023；

2.南京中醫藥大學中醫脾藏象現代研究實驗室 南京 210023）

輕度認知功能障礙（Mild cognitive impairment,MCI）是由一個或多個認知領域（包括記憶力，注意力，執行功能，語言或視覺空間能力）受損而定義[1-2]，它作為癡呆的前驅階段，發展為癡呆的幾率明顯增加，最新研究表明MCI年齡大于65歲的患者隨訪2年累積癡呆發生率為14.9%[3]。一旦癡呆形成，必然給患者、家庭和社會帶來極大的痛苦和負擔。現有藥物在一定程度上能控制和緩解MCI癥狀，但治療效果并不理想，因此尋找高效藥物以延緩并控制MCI的發生發展具有重要的社會意義。滋補脾陰方藥由人參，山藥，茯苓，白芍，丹參，白扁豆，蓮子，石菖蒲，遠志，檀香，陳皮，甘草12味中藥組成，課題組前期研究發現該方可以改善學習和記憶能力，并具有顯著的神經保護作用[4-5]，但其作用的物質基礎尚未清晰闡明。

作為藥理學研究的新領域，整合藥理學（integrative pharmacology，IP），是研究多成分藥物與機體相互作用及其整合規律和作用原理的一門學科[6]。整合藥理學不僅可以被廣泛應用到中藥方劑藥效物質基礎、作用機制、配伍規律等方面，以促進中藥現代研究水平，而且，可以探索多成分組合藥物的研究方法，為開創中西醫統一的新醫藥學奠定基礎[7]。因此，利用整合藥理學平臺，探究滋補脾陰方藥防治輕度認知功能障礙的物質基礎與作用機制，不僅有助于解決篩選物質基礎時間周期長的問題，還有助于解決探尋作用機制時單靶局限性問題，便于探究滋補脾陰方藥的主要活性成分群和靶標群，闡述滋補脾陰方藥物質基礎和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究應用的軟件為中藥整合藥理學計算平臺（TCM-IP，www.tcmip.cn）v1.0[8]。目前有4大數據庫：中藥方劑數據庫、中藥材數據庫、中藥成分數據庫、疾病/癥狀靶標數據庫。該平臺由中國中醫科學院中藥研究所聯合北京大學藥學院、中國科學院相關機構構建。

1.2 檢索、查詢

從中藥材數據庫獲得滋補脾陰方藥12味中藥的名稱、拉丁名、性味歸經、產地、功效及其所含化合物等信息；從中藥成分數據庫中獲得12味中藥的CAS號、相對分子質量、物理化學性質以及藥物代謝性質等。在疾病/癥狀靶標數據庫中，以“Mild cognitive impairment”作為疾病或癥狀關鍵詞進行檢索，獲得治療“Mild cognitive impairment”的藥物名稱、藥物療效、藥物靶標的基因和蛋白質相關信息。

1.3 靶標預測和共性靶標分析

采用二維結構相似性搜索（即MACCS分子指紋），采用開源軟件OpenBabel提取化學指紋特征，使用Tanimoto系數定義的相似度計量方法，與FDA上市藥物進行相似性打分（Score≥0.8），獲得滋補脾陰方藥作用的潛在靶標，建立藥物候選靶標信息數據庫。

1.4 網絡構建和分析、可視化

基于滋補脾陰方藥藥物靶標與MCI之間的相互作用網絡，建立滋補脾陰方藥靶標-MCI基因互作網絡；以“節點連接度（degree）”的2倍中位數為卡值，選取滋補脾陰方藥靶標-輕度認知功能障礙基因互作網絡的核心節點（hubs）；在構建關鍵節點子網的基礎上，以“degree”、“節點緊密度（closeness）”和“節點介度（betweenness）”的中位數為卡值，選取同時滿足3個卡值的節點為滋補脾陰方藥治療MCI失衡網絡的候選靶標；然后，通過對上述滋補脾陰方藥候選靶標參與的功能與通路進行富集分析，進一步挖掘滋補脾陰方藥緩解MCI關鍵病理的分子機制，構建“滋補脾陰方藥-中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路”的多層次網絡關聯圖。

1.5 基因功能分析與通路分析

基于基因本體數據庫（gene ontology，GO）和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）通路數據庫，提取滋補脾陰方藥靶標的分子功能（molecular function）、細胞內定位（subcellular localization），及其所參與的生物學反應（biological process）和通路（pathway），進行富集計算。針對滋補脾陰方藥直接作用靶標及其治療MCI的核心靶標，進行基因功能分析與通路分析。

表1 “中藥-成分-靶標”基本信息

2 結果

2.1 滋補脾陰方藥靶標預測和共性靶標分析

通過篩選，得到滋補脾陰方藥成分687種，其中人參的成分數量最多有158種，蓮子的成分數量最少僅10種，成分數目及靶標總數目見表1。共性靶標分析顯示，滋補脾陰方藥中12味中藥之間存在協同作用，其中人參、山藥、白芍、白扁豆等藥物間共性靶標較多，說明這幾味中藥協同作用較強。共性靶標分析結果見表2。

2.2 滋補脾陰方藥治療MCI的候選靶標基因互作網絡分析

以節點連接度的2倍中位數為卡值，構建滋補脾陰方藥靶標-MCI基因互作網絡關鍵節點子網見圖1；以節點連接度、節點緊密度和節點介度的中位數為卡值，選取滋補脾陰方藥治療MCI網絡的候選靶標，共計595個，排名前10見表3，關鍵靶標對應的化合物及中藥來源顯示在表4中，并構建“滋補脾陰方藥-中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路”的多層次網絡關聯圖，見圖2。

2.3 滋補脾陰方藥治療MCI的關鍵靶標富集分析

2.3.1 關鍵靶標的GO富集分析

對滋補脾陰方藥直接作用靶標及其治療MCI的核心靶標進行基因功能分析，根據P值排名前10位展示在表5中。

表2 滋補脾陰方藥中單味藥材間共有靶標分析結果

圖1 滋補脾陰方藥靶標-MCI基因互作網絡中的核心節點子網

2.3.2 關鍵靶標的KEGG通路富集分析

對滋補脾陰方藥直接作用靶標及其治療MCI的核心靶標進行通路分析，總共獲得190條通路，根據P值排名前10位展示在表6中。

3 討論

滋補脾陰方藥是戰麗彬教授在多年臨床實踐基礎上，根據清代·吳澄《不居集》中資成湯化裁而成，由人參，山藥，茯苓，白芍等藥物組成。全方共奏培補后天、滋補脾陰、活血化痰、安神益智之效。通過對計算得到的滋補脾陰方藥與輕度認知功能障礙的相關有效物質進行文獻驗證，發現人參中的人參皂苷Rb1[9]、Rh1[10]、Rg3[11]、Rg1[12]，白芍中的芍藥苷[13]，丹參中的丹參酮[14]、丹參多酚酸[15]，茯苓中的茯苓多糖[16]，遠志中的遠志皂苷[17]等均有相關文獻報道，證明了此研究方法的合理性。共性靶標分析顯示，共靶數目較多的有人參-山藥290個，人參-白芍103個，人參-白扁豆113個，人參-甘草110個，人參-遠志72個，人參-丹參68個，白扁豆-山藥109個，說明這些藥物之間協同作用較強。而陳皮、檀香、石菖蒲、蓮子與其他藥物之間的共靶數目較少，說明這些藥物協同作用較弱，提示滋補脾陰方藥中治療MCI的核心藥物可能是人參、山藥、茯苓、白扁豆、白芍、丹參、遠志和甘草。

表3 滋補脾陰方藥治療MCI的候選靶標名稱及其相關網絡拓撲特征參數值

表4 滋補脾陰方藥治療MCI關鍵靶標對應的化合物、中藥來源及所參與主要信號通路

圖2 “滋補脾陰方藥-中藥材-化學成分-核心靶標-關鍵通路”多層次網絡關聯

表5 滋補脾陰方藥治療MCI關鍵靶標GO富集分析結果

通過網絡分析，滋補脾陰方藥治療MCI排在前10位的關鍵靶標有HADHA（羥酰輔酶A脫氫酶三功能多酶復合物亞基α）、HADH（羥酰-CoA脫氫酶）、NSDHL（NAD（P）依賴類固醇脫氫酶樣）、PLCD1（1-磷脂酰肌醇4,5-二磷酸磷酸二酯酶δ-1）、ADH1A（乙醇脫氫酶1A）、ALDH3A2（脂肪醛脫氫酶）、GCK（葡萄糖激酶）、ADH1C（乙醇脫氫酶1C）、ENPP1（核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族成員1）、ADCY2（腺苷酸環化酶2型）。這些關鍵靶標主要來源于人參中的三磷酸腺苷、甘露糖、蔗糖、木糖、果糖、甘露糖、甘露糖-b、麥芽糖、腺苷，山藥中的植酸、D-甘露糖、D-葡萄糖苷、木糖、半乳糖、3,4,6-Trihydroxyphenanthrene-3-O-β-d-D-吡喃葡萄糖苷，白芍中的1-O-沒食子酰基-葡萄糖，遠志中的遠志糖醇，白扁豆中的水蘇糖、麥芽糖、蔗糖，甘草中的異甘草甙、新異甘草甙、甘草酸、甘草皂苷B2、甘草皂苷C2、甘草皂苷D3、甘草皂苷H2、烏拉爾甘草皂甙A、烏拉爾甘草皂甙B，并且可能在滋補脾陰方藥防治MCI中發揮重要作用。通過GO富集分析發現，這些關鍵靶標主要定位于細胞質、線粒體等，常見的分子功能是ATP結合、蛋白結合等，并參與調控三羧酸循環等過程。KEGG通路分析顯示這些關鍵靶標參與嘌呤代謝、核苷酸代謝、碳代謝、碳水化合物代謝等通路。嘌呤代謝通路中的代謝產物尿酸水平與認知障礙密切相關[18]。神經退行性疾病中存在核苷酸代謝障礙[19]。碳代謝中的葉酸和維生素B12通過參與機體細胞生物甲基化和DNA的合成，以及機體奇數鏈脂肪酸和某些氨基酸的線粒體代謝過程，對神經基因的表達進行調節。若代謝過程受到干擾，就會對機體神經組織造成一定的影響[20]。碳水核苷酸代謝的紊亂化合物是生命細胞結構的主要成分及主要供能物質，并且有調節細胞活動的重要功能。機體中碳水化合物的存在形式主要有三種，葡萄糖、糖原和含糖的復合物。葡萄糖是大腦重要的能量物質，大腦葡萄糖代謝障礙與認知障礙密切相關[21]。上述分析結果與已知文獻報道有一定的吻合，說明了TCMIP預測的準確性，為進一步深入闡釋滋補脾陰方藥的作用機制提供科學依據。

表6 滋補脾陰方藥治療MCI關鍵靶標KEGG富集分析結果

綜上所述，本研究利用整合藥理學平臺，以中醫藥大數據為支撐，采用人工智能“數據挖掘”網絡科學等學科的方法與技術，多靶點、多方位、多層次地對滋補脾陰方藥的活性成分、藥物靶點和MCI信號通路進行了探索性研究。研究結果初步驗證了滋補脾陰方藥防治MCI的物質基礎與作用機制，既體現了滋補脾陰方藥多成分、多靶點、協同作用的特點，也為進一步深入探討作用機制奠定了良好基礎。整合藥理學平臺作為一種新興的中藥現代研究手段，還存在一定的局限性，若要將得出的結論應用于臨床，仍需體內外實驗的驗證。同時，本研究未考慮中藥的劑量以及煎煮過程中活性成分的變化，因此還需要進一步深入研究探討。