黃連膏通過PI3K/AKT/eNos通路促進模型小鼠創面血管生成的實驗研究＊

張曉芬，宋 靜，李洪昌，陳亞峰，奉典旭＊＊

（1.河南中醫藥大學護理學院 鄭州 450046；2.河南省柘城縣人民醫院護理部 柘城 476220；3.上海中醫藥大學附屬普陀醫院普外科 上海 200062）

黃連膏最早見于外科專著《劉涓子鬼遺方》，至清代《醫宗金鑒》形成了用于中醫外科治療皮膚創面疾病的“經典”處方，由黃連、黃柏、生地黃、當歸、姜黃五味藥組成。其中黃連、黃柏清熱解毒，利濕排膿；生地清熱涼血養陰；當歸、姜黃活血化瘀，袪腐生新，全方共奏清利濕熱、活血化瘀，袪腐排膿生新的作用，主治濕熱諸瘡。黃連膏在臨床應用廣泛，療效顯著，本課題組在前期已經證實黃連膏能夠增加成纖維細胞生成、提高TGF-β、膠原蛋白的蛋白含量而促進創面愈合[1]。但對于其治療的作用機制，特別是在細胞、分子和基因的水平的實驗研究還有待探討，因此本研究從黃連膏治療創面愈合的機理及其對小鼠創面血管生成的影響進行探尋，以其為臨床運用黃連膏提供更充實的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物及主要試劑與儀器

實驗用生藥材均購自中國上海同仁堂制藥公司，上述藥材質量標準參照2005年版《中華人民共和國藥典》一部；麻油購自河南南陽和潤糧油有限公司。藥材黃連18 g、黃柏18 g、生地黃60 g、當歸30 g、姜黃18 g浸入720 g麻油中浸泡72小時，將麻油及藥入鐵鍋內，文火使藥料炸至表面呈深褐色，中部焦黃為度，在無菌操作臺濾去藥渣，待溫度降至適宜90℃時，再將50 g蜂蠟加入其中，文火徐徐收膏、裝瓶，常溫保存備用。基質膏配置方法同上，主要成分為麻油和蜂蠟（按麻油、蜂蠟72∶5配置）。CD-31兔來源多克隆抗體購自英國Abcam公司，Alexa flour 488標記的羊抗兔二抗、pAKTs308、pAKTs437、AKT兔來源單克隆抗體均購自購自美國CST公司，兔多克隆抗體VEGF-A，兔單克隆抗體eNOS購自英國Abcam公司。辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗購自碧云天生物技術有限公司。Real time RCR擴增儀Vii ATM7型購自美國ABI公司，超凈工作臺購自中國Haier公司；熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 動物及分組處理

C57BL/6J雄性健康無特殊病原體級小鼠45只，8-10周齡，體重20～25 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司（生產許可證號SCXK（滬）2012-0002）提供，飼于上海中醫藥大學附屬普陀臨床醫學院動物房（動物實驗室許可證號為SYXK（滬）2013-0055）。混合飼料單籠飼養，自然光照射，室溫控制在20℃左右。本次實驗動物征得上海中醫藥大學附屬普陀臨床醫學院動物倫理委員會同意。實驗性小鼠適應性飼養l周后，按Asai J等[2]的方法，用8%硫化鈉脫去后背部區域的毛發，溫水清洗拭干。褪毛l天后小鼠行2.5%戊巴比妥鈉按公斤體重40 mg/kg腹腔內注射，麻醉成功后，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒術區，在小鼠后背部正中用角膜環鉆剪去一塊直徑為7.5 mm的圓形，全層切除皮膚，開放創面，充分止血。待清醒后單籠飼養，按完全隨機數字表法隨機分組，分為基質組15只；黃連膏組15只，空白對照組15只分別做好組間標記。創傷模型制成后，從第1天開始局部用藥治療，每次換藥時創面先用碘伏局部消毒清洗后，分別外敷給藥，以填充滿創面為準，黃連膏組小鼠的創面外敷黃連膏，基質組創面外敷基質膏，空白對照組15只用碘伏局部消毒清洗不敷任何藥物，每日兩次，分別于上午8:00時和下午8:00時各換藥1次。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1 創面觀察及愈合率測定

于造模后第0、3、7、10、14天，觀察創面大體情況并用數碼相機拍照，將創面圖像資料輸入高分辨率計算機，跟蹤創面邊緣并計算出創面區域。用醫療專用圖分析軟件Image J予以分析，取得面積數據，計算出創面愈合率[3]。創面閉合的百分率使用下列方程計算：

創面愈合率=（原始創面面積一殘余創面面積）/原始創面面積×l00%

1.3.2 免疫組織熒光觀察

切片常規脫蠟和水化，組織抗原修復，血清封閉，滴加兔多克隆CD-31一抗（稀釋比均為1∶200），4℃孵育過夜；第二天取出爬片，洗去一抗反應液，PBS沖洗3次，滴加單克隆Alexa flour 488標記的羊抗兔二抗（稀釋比均為1∶1 000），避光孵育30 min，進行DAPI核染，每張爬片滴加20 uL抗熒光淬滅封片液，輕覆上蓋玻片，顯微鏡下觀察并采集圖片，圖像輸入計算機中，應用圖像分析軟件Image J計算陽性染色區域熒光的強度并量化。

1.3.3 bFGF和PDGF的mRNA水平的檢測

RT-PCR用來檢測不同治療組在不同的時間（3天、7天、14天）bFGF和PDGF的mRNA水平變化。取創面組織，在液氮冷凍環境下研磨，加TRIzol 1 ml，照說明書提取總RNA,反轉錄為cDNA，常規PCR擴增，擴增條件為95℃預變性4 min，95℃變性20 s，55℃退火20 s，75℃延伸50 s，45個循環，75℃再延伸8 min。mRNA水平分析采用ΔΔCt方法，引物序列信息由上海華大分子生物技術研究所合成。

1.3.4 AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達

采用蛋白質印跡法檢測。2組各取凍存創面組織0.1 g，加組織裂解液勻漿，提取蛋白并定量。蛋白樣本均以50 μg上樣，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電脈，濕法轉至聚偏二氟乙烯膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔單克隆AKT（稀釋比均為1∶ 2 000）、pAKTs308、pAKTs437、兔單克隆抗體eNOS一抗、兔多克隆抗體VEGF-A（稀釋比均為1∶1 000），4℃孵育過夜。加入山羊抗兔IgG二抗（稀釋比為1∶ 5 000），室溫1小時振蕩孵育，化學發光、顯影，凝膠圖像分析系統行灰度掃描分析，系統自帶軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH為內參照，結果以AKT、VEGF、eNos與GAPDH灰度值的比值表示。本實驗重復3次。

1.4 統計學處理

本組數據采用SPSS 21軟件包進行處理，計量資料用均數±標準差（x-±S）表示，對CD31計數、bFGF和PDGF的mRNA水平等計量指標多組均數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較行Tukey檢驗，對不同時間創面愈合率的比較采用重復測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 創面大體觀察及愈合率

傷后0 d，3組小鼠創面均紅腫；傷后3 d，3組小鼠創面痂皮薄、面積較大，無紅腫，基質組小鼠伴有輕度滲出；傷后7 d，3組小鼠創面均干燥，結痂無紅腫、滲出。傷后10 d，3組小鼠創面面積明顯縮小，黃連膏組小鼠創面痂皮部分脫落；基質組小鼠創面痂皮變厚，部分脫落，創面縮小面積小于同時相點黃連膏組。空白對照組創面痂皮變厚，無脫落，傷后14 d，黃連膏組小鼠大部分創面愈合，創緣周邊較多被毛覆蓋；基質組和空白對照組小鼠創面尚未完全愈合，創緣周邊較少被毛覆蓋。見圖1。

表1 引物序列表

傷后3、7 d小鼠創面愈合率，黃連膏組、基質組、空白組對照組相近（P值均大于0.05）；傷后10、14 d，黃連膏組小鼠創面愈合率顯著高于基質組和空白對照組（P值均小于0.01）。3組小鼠傷后7、10、14 d創面愈合率均顯著高于組內前一時相點（P值均小于0.01）。見表2。

2.2 對小鼠創面組織CD-31形成的影響

CD-31是血管內皮細胞標記物，因此我們選用CD-31免疫熒光來標記各組小鼠第3、7天創面組織血管生成的影響。結果顯示黃連膏組傷后3 d創面組織中CD-31陽性細胞百分率明顯高于基質組和空白對照組（P＜0.05），傷后7 d，黃連膏組創面組織中CD-31陽性細胞百分率明顯高于基質組和空白對照組（P＜0.01）；傷后3、7 d基質組和空白對照組創面組織中CD-31陽性細胞百分率無差異（P＞0.05）；3小鼠傷后3、7 d創面組織中CD-31陽性細胞百分率顯著高于組內前一時相點（P＜0.01或P＜0.05）。見表3。

圖1 3組全層皮膚缺損小鼠各時相點創面大體情況

2.3對小鼠創面組織bFGF和PDGFmRAN水平的影響

表2 3組全層皮膚缺損小鼠傷后各時相點創面愈合率比較（%，±S）

表2 3組全層皮膚缺損小鼠傷后各時相點創面愈合率比較（%，±S）

注：處理因素主效應，F=6.76，P＜0.05；時間因素主效應，F=579.95，P＜0.01；兩者交互作用，F=12.08，P＜0.01；t值、P值為組間同時相點比較所得，t1值、P1值為黃連膏組與基質組相比較；t2值、P2值為黃連膏組與空白組相比較；t3值、P3值基質組與空白對照組相比較；F值、P值為組內各時相點總體比較所得；與組內前一時相點比較，aP＜0.01。

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圖2 小鼠創面組織CD-31陽性細胞（第7天，免疫熒光圖×400），綠色熒光代表CD-31陽性細胞

表3 局部應用黃連膏對小鼠創面CD-31陽性細胞數的影響

傷后3、7 d，黃連膏組小鼠創面組織中bFGF的mRAN水平明顯高于基質組和空白對照組（P值均小于0.01）；傷后14 d，基質組和空白對照組小鼠創面組織中bFGF的mRAN水平達到最高，明顯高于黃連膏組（P＜0.05）。黃連膏組小鼠傷后7 d創面組織中bFGF的mRAN水平均顯著高于組內前一時相點（P＜0.01），傷后14 d黃連膏組bFGF的mRAN水平低于組內前一時相點（P＜0.01），基質組和空白對照組，傷后3、7、14 d創面組織中bFGF的mRAN水平均顯著高于組內前一時相點。傷后3、7 d，黃連膏組小鼠創面組織中PDGF的mRAN水平明顯高于基質組和空白對照組（P＜0.01或P＜0.05）；3組小鼠傷后3、7 d創面組織中PDGF mRAN水平均顯著高于組內前一時相點（P＜0.01）。傷后14 d，3組小鼠創面組織中PDGF mRAN水平無明顯差異（P＞0.05），見表4和表5。

2.4 對AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達影響

結果顯示黃連膏組傷后7d創面組織中P-AKTS308和P-AKTS437明顯高于基質組和空白對照組（P＜0.05或P＜0.01），VEGF-A和eNOS的蛋白含量也明顯高于基質組和空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。見表6及圖3。

表43 組小鼠各時相點創面組織中bFGFmRNA水平比較（x-±S）

表53 組小鼠各時相點創面組織中PDGFmRNA水平比較（x-±S）

表6 黃連膏對小鼠創面傷后7d創面組織中AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達影響

3 討論

修復創面的肉芽組織中含有大量的新生血管，為創面組織的生成提供充分的氧氣和營養物質，因此血管的生成是組織修復的前提和基礎，是創面修復過程中的重要環節。其中VEGF-A、PDGF和bFGF是最重要的促進血管生成的因子。VEGF是血管內皮細胞特定的有絲分裂原，通過促進血管內皮細胞遷移和增殖參與支持早期血管生成，對血管生成起著非常重要的促進作用。據報道[4]從當歸和川芎提取物可影響心肌梗死大鼠VEGF的表達，促進血管內皮細胞增殖，提高雞胚絨毛膜尿囊模型毛細血管的數量。同樣，據研究[5]當歸的水提物可以提高人臍靜脈內皮細胞增殖、遷移、入侵和在人工基底膜基質的血管形成以及通過增強VEGF表達和刺激p38磷酸化作用促進斑馬魚體內血管生成。同時有報道[6]生地可以通過提高VEGF-A的表達，促進糖尿病大鼠創面血管生成。最近的研究報告指出，生地黃具有促進創面血管生成，增強VEGF的表達[7-8]。在我們的實驗中發現，黃連膏治療組創面在第3、7天VEGF-A的mRNA表達明顯高于基質組。CD 31是創面微血管組織中血管內皮細胞增殖的標記物，因此我們同時采用免疫熒光檢測了各組創面CD31陽性表達率，結果表明，第3、7天小鼠創面組織，發現黃連膏組免疫熒光強度明顯高于基質組和空白對照組，可見黃連膏中藥能明顯促進小鼠創面組織的血管生成。

圖3 蛋白質印跡法檢測傷后7天3組小鼠AKT、VEGF-A、eNos的蛋白表達

PI3K是一種細胞內磷脂酰肌醇激酶，其激活后通過與Akt結合，促進Akt磷酸化，AKT（也稱為蛋白激酶B，PKB）是PI3K下游信號通路中最為重要的一個蛋白，其激活需要其2個重要的位點發生磷酸化，分別是位于激活結構域的thr308位點和Ser473位點。激活的AKT從細胞膜轉移到細胞質和細胞膜，通過磷酸化作用磷酸化激活生成NO（nitric oxide，NO）的關鍵限速酶eNOS（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），從而調控創面血管生成[9,10]。NO通過促進內皮細胞遷移、增殖和存活在血管生成過程中起著至關重要的作用[11]。據報道[12]姜黃素能夠使內皮祖細胞的eNOS基因表達上調從而促進了NO分泌，促進血管生成。本研究亦顯示，黃連膏治療組傷后7d創面組織eNOS的蛋白含量也明顯高于基質組和空白對照組，并且磷酸化的AKTS308和AKTS437兩個位點蛋白含量明顯高于基質組。

由此可見黃連膏外用可以促進全層皮膚切除小鼠創面的愈合速度，促進創面毛細血管的生成，可能通過調節PI3K/AKT/eNOS信號通路促進AKTS308和AKTS437兩個位點磷酸化，調節eNOS、VEGF-A的蛋白表達，促進PDGF和bFGF的生成有關。

中藥治療疾病特點是多靶點、多渠道發揮作用，未來還應進一步的從創面愈合的其它方面，如黃連膏與表皮上皮化、與其它生長因子、及分子、細胞方面探討黃連膏對創面的愈合作用。