高效液相色譜法同時測定鼠曲草中槲皮素與木犀草素的含量＊

許贊杉，林小華

（廈門醫學院藥學系 廈門 361023）

鼠曲草為菊科鼠曲草屬植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥全草，又名清明菜、佛耳草、追骨風、土茵陳等，主要分布在亞洲地區，以我國和朝鮮、菲律賓等地多見[1]。其性平，味甘，具有化痰止咳、祛風平喘、除濕止痹之功效，主治感冒咳嗽、支氣管炎、哮喘、高血壓、蠶豆病、風濕腰腿痛等[2-3]。另一方面，鼠曲草自古以來就一直作為野菜而被人們食用[4]。有研究表明，鼠曲草中含有二萜類、生物堿和黃酮等化合物，其中黃酮類為主要活性成分[5-7]。現代藥理研究發現黃酮類化合物具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝作用，具有保護心腦血管系統和抗病毒等廣泛的生理活性[8-9]。目前關于鼠曲草化學成分含量測定的研究報道較少，僅見槲皮素的測定[10]，為深入挖掘我國寶貴的中藥資源，本實驗采用HPLC法，同時測定鼠曲草中槲皮素和木犀草素含量，該方法簡便準確，可以用來更好地控制和完善鼠曲草藥材的質量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters e2695高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、2998二極管陣列檢測器），Empower色譜工作站；SY25-1200型超聲波清洗器（張家港市三友超音設備廠）；RT-04型多功能粉碎機（臺灣鴻翔藥材器械廠）；XPE105型電子太平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；DHG型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-S型水浴鍋（上海君竺儀器制造有限公司）；0.45 μm微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（含量98%，批號C20J6Y1722，上海源葉生物科技有限公司）；木犀草素對照品（含量98%，批號Y01D656815，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；磷酸（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（自制）；其他試劑均為分析純。鼠曲草采摘于廈門汀溪水庫、東嶺水庫和坂頭水庫，經廈門醫學院中藥教研室向云亞老師鑒定為菊科植物黃花鼠曲草的全草。

圖1 對照品混合溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18(2)（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（42:58）；檢測波長：360 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。在此色譜條件下，槲皮素和木犀草素均達到基線分離（R＞1.5），理論塔板數均不低于4 000，分離色譜見圖1、圖2。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素與木犀草素對照品各17.94 mg、6.47 mg，分別置10 mL量瓶中，各加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含1794 μg的槲皮素對照品儲備液和每1 mL含647 μg的木犀草素對照品儲備液。精密吸取上述2種對照品儲備液各2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取鼠曲草粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液各0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的混合對照品溶液。取上述對照品混合溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣并測定，以質量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得槲皮素的回歸方程為Y=664 19X+187 63（R2=0.999 6），木犀草素的回歸方程為Y=762 59X+5 987（R2=0.999 4），表明槲皮素質量濃度在3.588-35.880 μg·mL-1（R2=0.999 6）范圍內線性關系良好，木犀草素質量濃度在1.294-12.940 μg·mL-1（R2=0.999 4）范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗

精密吸取含槲皮素 21.528 μg·mL-1、木犀草素7.764 μg·mL-1的混合對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.62%(n=6)、2.46%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗

取按“2.2.2”項下制備條件制成的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為0.71%(n=6)、0.78%(n=6)，結果表明槲皮素和木犀草素的量均未發生明顯的改變，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 重復性實驗

精密稱取同一鼠曲草樣品粉末6份，每份約2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.38%(n=6)、1.15%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的鼠曲草樣品粉末6份，每份約1 g，分別精密加入一定量的槲皮素和木犀草素對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率，測得量帶入“2.3.1”項下線性方程中，顯示在線性范圍內，結果見表1。

2.4 樣品含量測定

精密稱取3個不同產地的鼠曲草藥材粉末各2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，用外標法計算各樣品中槲皮素和木犀草素的含有量，結果見表2。

3 討論

3.1 流速的選擇

本實驗分別在0.8、0.9、1.0mL·min-13個流速下對樣品進行分析，結果顯示在流速為1.0 mL·min-1時，槲皮素和木犀草素的分離效果較佳，故選取此流速為最佳流速。

3.2 柱溫的選擇

我們考察了25、30、35℃3個柱溫，在其他色譜條件相同的情況下進樣分析，考察基線、峰形、出峰時間等參數，以確定最合適的柱溫。結果顯示柱溫在30℃時，槲皮素和木犀草素的分離效果較佳，均能夠達到基線分離，故選此柱溫為最佳柱溫。

3.3 色譜柱的選擇

本實驗選用了不同色譜柱進行比較：Agilent SBC18（4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)以及Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)。結果顯示Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱響應值最好，樣品各組分分離度好，故選用其作為本實驗的色譜柱。

3.4 檢測波長的選擇

本實驗采用二極管陣列檢測器在190-400 nm波長進行掃描，結果發現槲皮素在254 nm和364 nm處有最大紫外吸收，木犀草素在253 nm和350 nm處有最大紫外吸收（見圖3、圖4）。因此我們考察了不同吸收波長（254 nm、350 nm、360 nm）的吸收圖譜，發現在360 nm處兩者均有較強吸收并且干擾很少，圖譜特征性強，故選取360 nm作為本實驗的檢測波長。

3.5 流動相的選擇

根據文獻[11-12]，對比考察了乙腈-0.1%乙酸溶液（25∶75）、甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）、甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）3種流動相，并考察了梯度洗脫模式，觀察樣品中槲皮素和木犀草素的分離情況。結果表明，選擇甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）為流動相時槲皮素和木犀草素的響應值好，峰形良好，理論塔板數、分離度、拖尾因子等均符合要求。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

表2 樣品含量測定結果（n=3）

圖3 槲皮素紫外吸收光譜圖

圖4 木犀草素紫外吸收光譜圖

3.6 提取方法的選擇

本實驗考察了直接超聲提取和石油醚索氏提取后超聲提取兩種方法，結果表明兩種方法測得的含量基本無差異，故選擇直接超聲提取法；提取溶劑的選擇我們比較了不同濃度的甲醇（60%甲醇、75%甲醇、80%甲醇）和不同濃度的乙醇（60%乙醇、75%乙醇、80%乙醇）的提取效率，結果表明用60%乙醇提取效果最好；同時考察了超聲提取15 min、30 min和45 min，結果表明超聲提取15 min未能提取完全，而超聲提取30 min與 45 min基本無差異，故選擇超聲提取30 min的提取方法。根據實驗結果最終確定樣品的提取方法為采用60%乙醇超聲提取30 min。

3.7 不同產地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的比較

由表2可以看出，不同產地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的含量不同，槲皮素在0.39-0.58 mg·g-1之間，木犀草素在0.17-0.27 mg·g-1之間，有一定的波動。二者均以汀溪水庫為最高，坂頭水庫次之，東嶺水庫最低，這可能與鼠曲草的產地環境、氣候溫度、生長方式、采摘時間等因素有密切關系。因此，從黃酮類成分的資源利用角度來看，汀溪水庫的鼠曲草質量最好，故建議在以鼠曲草作為藥源時應考慮同種藥材不同產地的含量差異。

綜上，該方法簡便快速、準確可靠、重現、精密度、穩定性、回收率都較好，可以用來更好地控制和完善鼠曲草藥材的質量標準。