小鼠中年期和老年期睪丸組織轉錄組分析

張 濤，楊理凱，路宏朝，王 令，劉 歡，左甜甜

(陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西漢中 723001)

老齡化問題已成為世界各國面臨的共同課題，中國老齡化速度不斷加快。衰老涉及內分泌系統多個方面的改變，包括腎上腺、甲狀腺、垂體生長激素、性腺、骨礦物質代謝和糖代謝等[1-2]。Holladne等在1958年發現老年男子的睪丸精索靜脈睪酮水平低于青年男子[3]，是衰老降低睪酮產生的有力證據。近年來，學者把由老齡化所導致的血液中雄激素低下為生物化學基礎的癥候群稱之為“部分雄激素缺乏綜合征(partial androgen deficiency of agingmale,PADAM)”，臨床表現為失眠、健忘、性功能障礙等多種老年性疾病[4-5]。睪丸是精子產生的場所，并分泌雄激素。精子在曲精小管中從精原干細胞到精母細胞，然后通過減數分裂形成精子，該過程也涉及睪丸中支持細胞及間質細胞等。睪丸支持細胞分布在曲精小管，負責生殖細胞的營養與保護，而間質細胞分布于睪丸間質中[6]，在腦垂體分泌的黃體生成素作用下，生成和分泌雄激素——睪酮，促進性腺發育、精子發生，維持男性性征[7]，男性40歲后隨著年齡的增長，下丘腦-垂體-睪丸軸功能減退，睪丸功能降低。

睪丸作為雄性的主要標志器官，其生長發育是一個復雜而精密的生理過程，隨著年齡老化而出現睪丸內分泌變化與功能衰退，多數學者認為是由于衰老對下丘腦-垂體-睪丸軸功能產生影響而導致，目前已開展大量人與動物睪丸發育[8]、損傷與保護[9]及組織中基因表達差異[10]等研究，但是相關的生理機制和分子機理仍然沒有闡述清楚。測序技術的出現為人類從分子水平解析生命的奧秘提供新的途徑，轉錄組測序與分析技術的應用已經有20多年，廣泛應用于生物學的研究，且對小鼠不同發育階段睪丸組織中不同類型細胞的基因表達進行研究[11-13]，但多數研究集中在胚胎期、幼年、青年和成年期，而關于中年期和老年期的睪丸組織的轉錄組研究未見報道。本研究選取出生后180日齡和360日齡小鼠，分別代表中年期和老年期，采用Illumina Hiseq測序平臺對睪丸組織的基因表達情況進行比較分析，為探討睪丸功能退化的分子機制提供基礎數據，以期為老齡化過程中生物學與醫學等某些方面科學問題的解決提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

C57BL小鼠購自第四軍醫大學實驗動物中心，實驗室長期飼養，選取中年期(180日齡)和老年期(360日齡)的睪丸組織進行研究。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取 每只小鼠取 1 個睪丸，按照Trizol Reagent 試劑盒的操作流程提取總RNA，測定質量濃度后按照中年期和老年期 2 個組分別將 3 個樣本等量混合構建 cDNA 文庫。

1.2.2 測序文庫的構建 基于 mRNA 特有的Poly(A)結構進行 mRNA 純化。通過離子打斷的方式將 mRNA 打斷為 200～300 bp。采用隨機引物和逆轉錄酶合成 cDNA 第 1 條鏈，合成第 2 條 cDNA 鏈時將 dTTP 替換成 dUTP，以提高結果的準確性。cDNA 文庫構建完成后，采用 PCR 擴增進行文庫片段富集，建立測序文庫，文庫大小在 300～400 bp，最后通過 Agilent 2100Bioanalyzer 對文庫進行質檢。

1.2.3 Illumina測序 選擇上海派森諾生物科技有限公司 Illumina Hiseq 測序平臺對文庫進行雙末端(Paired End，PE)測序 。

1.2.4 數據處理 采用 Cutadapt(Version 1.2.1)除去3′端的接頭，數據平均含量按照 Q20 標準控制。進行比對的參考基因組數據來源為 Ensembl 數據庫(http:∥www.ensembl.org/)，參考的基因組信息為Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa，數據庫版本為 Ensembl 86.38。通過 Bowtie2 建立參考基因組索引，然后使用 Tophat2(http:∥tophat.cbcb.umd.edu/)將過濾后的 Reads 比對到參考基因組上。

1.2.5 差異基因篩選 使用 HTSeq 0.6.1p2(http:∥wwwhuber.embl.de/users/anders/HTSeq)統計比對到每一個基因上ReadCount 值，作為基因的原始表達量。采用 RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)[14]對表達量進行標準化(Normalization)。采用 DESeq(version 1.18.0)[15]對基因表達進行差異分析，篩選差異表達基因條件為：表達倍數差異 |fold change| > 2，顯著性P<0.05。采用 R 語言 ggplots2 軟件包繪制差異表達基因的火山圖和 MA 圖。

1.2.6 GO與KEGG分析 將所有檢測到的基因映射到GO(Gene Ontology)數據庫每一個 Term，計算每個 Term 的差異基因數目，以整個基因組為背景，采用超幾何分布計算差異基因顯著富集的 Term 及相應功能；在 KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數據庫比對差異表達基因，統計各個 KEGG Pathway 各層級的差異表達基因數目，確定差異表達基因主要參與的代謝途徑和信號通路。

2 結果與分析

2.1 數據質量檢測

由表1可知，2個樣品分別獲得25 479 636和 29 158 408 條 reads，總堿基數分別為3 847 425 036 bp和 4 402 919 608 bp，其中識別準確率在 99.9% 以上的堿基總數為 3 439 210 859 bp和 3 967 709 437 bp；Q20 值均在 95% 以上，Q30 在 89% 以上，結果表明測序質量好，保證研究的可靠性。為了排除接頭和低質量 Reads 對信息分析的干擾，試驗進行數據的過濾處理(表2)，試驗兩個樣品分別檢測到 25 187 980 個和28 840 576個有效的Reads，比對到參考基因組上的分別有 18 861 721 個和 22 355 657 個，占總讀數的 74.88% 和 77.51%。比對結果顯示比對效率較好，能比對到功能基因的比例分別為 76.51% 和 79.96%，其中比對到外顯子區的分別為 95.54% 和 96.06%，結果如表3所示，說明測序的數據豐富，有效性好。

2.2 差異表達基因的篩選

為系統了解小鼠中年期及老年期睪丸組織基因表達情況，筆者計算檢測到的每一個基因的 RPKM 值，如表4所示。轉錄組研究領域的主流雜志提出，在有參轉錄組當中，一般認為 RPKM>1的基因是表達的，RPKM 能夠很好地反應基因的表達水平。在中年期小鼠的睪丸組織可檢測到 17 770個基因的表達，其中 RPKM 值小于 1 的基因占 62.15%，大于 100 的基因占 0.80%；在老年期小鼠的睪丸組織中，檢測到 18 073 個基因的表達，其中 RPKM 值小于1的基因占61.45%，大于 100 的基因占 0.74%?；鹕綀D可直觀反映基因的分布情況，MA圖常用來評估文庫Normalization的質量，結果表明(圖1、圖2)中年期和老年期睪丸組織轉錄組表達水平存在較大差異。以中年期為對照，老年期表現下調基因 122 個，上調基因 185 個(圖3) 其中上調基因中可注釋的 181 個，下調基因可注釋的 104 個。所有差異表達基因中，RPKM>1 的基因共有 57 個，下調 18 個，上調 39 個。

表1 轉錄組測序數據評價分析Table 1 Evaluation of transcriptome sequencing data

表2 轉錄組測序數據比對結果基本統計Table 2 Basic statistics of transcriptome sequencing data

表3 轉錄組數據比對區域分布統計Table 3 Transcriptome data comparison regional distribution statistics

2.3 GO分類

利用 Blast2GO 軟件對 307 個差異表達基因進行分析表明，285 個基因可以分為生物過程、細胞組分和分子功能 3 大類別 25 小類，共涉及生物過程的 1 625 個條目，細胞組分的 244 個條目，分子功能的 333 個條目。 差異表達基因在細胞組分分類下主要涉及膜及其組成相關的各種功能，其中最多的是膜的整體組成(圖4)。在生物過程大類下基因涉及的生物學功能最復雜，涉及基因較多的是轉運、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄調控、氧化還原過程、轉錄調控與DNA模板化和老齡化。在分子功能分類中，氧化還原酶活性所占比例最多，其次是轉運蛋白活性、絲氨酸型內肽酶抑制劑活性、轉運體活性和裂解酶活性。此外，從圖4也可以看出，與生殖發育和衰老相關的生物學過程有細胞增殖調節、免疫系統過程、骨化、老化、絲氨酸型內肽酶抑制劑活性、氧化還原酶活性等。

表4 不同生長時期睪丸組織RPKM值Table 4 FPKM value of testis tissue in different growth stages

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Valcano chart of differentially expressed genes

圖2 差異表達基因MA圖Fig.2 MA chart of differentially expressed genes

圖3 中年期與老年期睪丸組織差異表達基因統計Fig.3 Statistics of differentially expressed genes in middle-and old-aged mouse

B1.炎癥反應正向調節 Positive regulation of inflammatory response； B2.氧化還原過程 Oxidation-reduction process；B3.骨化 Ossification；B4.老化 Aging；B5.運輸 Transport；B6.RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調節 Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter；B7.轉錄正調節，DNA模板化 Positive regulation of transcription, DNA-templated；B8.膜轉運 Transmembrane transport；B9.免疫系統過程 Immune system process；B10.調節細胞增殖 Regulation of cell proliferation；C1.細胞外外泌體 Extracellular exosome；C2.細胞外區域 Extracellular region；C3.內質網 Endoplasmic reticulum；C4.細胞外空間 Extracellular space；C5.內體 Endosome；C6.質膜的整體成分 Integral component of plasma membrane；C7.膜的整體組成部分 Integral component of membrane；C8.質膜 Plasma membrane；C9.膜 Membrane；M1.絲氨酸型內肽酶抑制劑活性 Serine-type endopeptidase inhibitor activity；M2.氧化還原酶活性 Oxidoreductase activity；M3.轉運體活性 Symporter activity；M4.裂解酶活性 Lyase activity；M5.運輸活動 Transporter activity；M6.肝素結合 Heparin binding

2.4 KEGG富集分析

通過KEGG 數據庫進行差異基因比對與富集，結果發現 301 個基因歸納到 5 個大類的 18 個小類中，共涉及 139 個信號通路，如圖5所示。結果表明，這些差異表達基因主要參與的前 5 個代謝通路為信號轉導、脂代謝、碳水化合物代謝、內分泌系統和神經系統。KEGG 歸類分析后，篩選出 RPKM>1 的 57 個基因，并統計分析這些基因涉及的信號通路，最終檢測到 20 個基因涉及 35 個信號通路(表5)。小鼠中年期睪丸組織有 6 個基因顯著上調，涉及PPAR 信號通路、脂類調控、補體系統、氮代謝、嗅覺轉導、吞噬體、腸免疫網絡、抗原加工與展示和細胞粘附分子等 9個信號通路。而在老年期檢測到 15 個基因上調，涉及20個信號通路，主要包括花生四烯酸代謝、卵巢類固醇生成、類固醇激素生成、醛固酮的生成與分泌、腎素血管生成素系統、血管平滑肌、腎素分泌、氨基酸代謝、催產素信號通路、促性腺激素釋放激素、TNF信號通路、甘油三酯代謝、補體系統、胰島素、溶酶體和鞘脂類代謝與信號通路。

A.異生素的生物降解和代謝 Xenobiotics biodegradation and metabolism;B.概述 Overview; C.核苷酸代謝 Nucleotide metabolism;D.其他氨基酸的代謝 Metabolism of other amio acids;E.油脂代謝 Lipid metabolism;F.聚糖生物合成和代謝 Glycan biosynthesis and metabolism;G.碳水化合物代謝 Carbohydrate metabolosm;H.氨基酸代謝 Amio acidsmetabolism;I.感官系統 Sensory system;J.神經系統 Nervous system;K.免疫系統 Immune system;L.內分泌系統 Endocrine system;M.循環系統 Circulatory system;N.信號分子和相互作用 Signaling molecules and interaction;O.信號傳導 Signal transduction;P.運輸和分解代謝 Transport and catabolism;Q.細胞群落 Cellular community;R. 翻譯 Translation

3 討論與結論

3.1 轉錄組測序可靠性分析

轉錄組測序技術為基因表達及調控研究和生物重要性狀候選基因的鑒定提供新的途徑，尤其在不同物種、不同發育階段及不同組織之間挖掘差異表達基因具有重要作用[16]。本研究通過 Illumina Hiseq 測序平臺分析檢測小鼠中年期和老年期睪丸組織的 cDNA 文庫，獲得小鼠睪丸組織在中、老年期大量的基因表達信息與變化差異，結果表明，選擇的試驗材料測序質量好，各樣品的 Q20 均在 95% 以上，Q30 均在 89%以上；在小鼠中年期和老年期睪丸組織分別檢測到 25 187 980 個和 28 840 576 個可用的 Reads，比對效率分別達到 74.88% 和 77.51%；測序質量高于前期小鼠睪丸組織 6 日齡 (52.87%) 4 周齡(56.70%)和 10 周齡 (62.35%) 的轉錄組測序結果[13]，也比其他物種如鴨卵巢組織(70.92%和72.70%)[16]和綿羊(68.05%和71.82%)[17]等組織的高。

3.2 中年期和老年期睪丸組織基因差異表達分析

自從轉錄組分析技術出現以來，科學家就將該技術應用到小鼠睪丸的基因表達研究，如抑制消減雜交(SSH)、表達序列標簽(expressed sequence tag,EST)、cDNA微陣列和基因表達系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)等技術。通過這些技術構建小鼠的睪丸體細胞基因表達譜，鑒定出大量小鼠睪丸組織唯一表達標簽，發現一些在睪丸生精細胞、支持細胞和間質細胞特異表達的基因，并在小鼠不同發育階段檢測到許多與精子生成有關的差異表達基因[11-12]。高通量轉錄組測序技術比傳統轉錄組分析技術更能敏感地檢測樣本間的基因差異表達。龔未等[13]采用超高通量新一代 Technologies SOLiD 測序平臺分析 6 日齡、4 周齡和 10 周齡小鼠睪丸組織的基因表達數據,鑒定出 18 837 個基因，同時鑒定不同發育階段差異表達的基因。但目前利用高通量轉錄組測序技術分析小鼠中年期和老年期睪丸組織的基因差異表達未見報道。

本研究對小鼠中年期和老年期睪丸組織cDNA文庫進行分析，共檢測到 307 個表達差異的基因，可注釋的 271 個，上調 173 個，下調 98 個，其中 264 個基因獲得 GO 功能注釋，187 個基因清楚涉及 KEGG 代謝通路。由于小鼠作為模式生物研究的比較深入，比對數據庫中的參考基因比較全面，所以本研究中檢測到差異表達基因功能在 GO、KEGG 中被注釋的比例比其他物種覆蓋度高。但是，也有一些基因沒有被注釋到，也沒有歸入到相應的 GO 和 KEGG 功能分類，分析原因可能是目前小鼠睪丸組織的研究多數集中于胚胎發育和青年期，而中年期和老年期的研究相對較少，而那些到中老年期后表達的一些特異基因沒有被發現，也有可能是轉錄組測序及拼接序列較短，獲得注釋信息的可能性就降低。

表5 差異表達基因涉及的信號通路Table 5 Differentially expressed genes involved in signaling pathways

3.3 差異表達基因的功能分析

GO 歸類分發現在細胞組分大類中涉及的基因比較集中，主要是膜相關類別，說明在小鼠中老年期和老年期睪丸生理活動中的差異表達基因主要與膜的生物學功能相關，同時也發現一些基因涉及細胞外的活動，該結果與龔未等[13]通過轉錄組分析技術研究小鼠出生后的基因差異表達研究是一致，說明細胞外活動相關基因貫穿小鼠睪丸整個生理生化過程。而在生物過程中差異表達基因涉及的范圍比較分散和多樣，各組分中相關基因數量較少，且差異不明顯，這與其前期關于小鼠睪丸組織和其他物種的研究基本一致，推斷生物過程在睪丸組織中是最基本的代謝途徑。對分子功能大類的分析發現，氧化還原酶活性所占比例最多，可能與老齡化密切相關，隨著年齡增大，需要大量的氧化還原酶發揮抗衰老的作用。此外，也檢測到明顯與生殖發育、性功能及衰老相關的差異表達基因。本研究結果證實膜相關、細胞外、轉運和氧化還原等類別在中老年睪丸組織中存在較大差別的基因表達，推測膜相關、細胞外、轉運和氧化還原在睪丸功能退化的生理活動中可能具有重要的作用。

遺傳學已經闡明，表型的產生有主效基因作用、微效多基因假說及其與環境互作效應等機制?，F代生物學研究證明生物體中不同類型的生物學功能由多個基因相互協調進行調控，形成一個精密的調控網絡，通過信號通路富集分析有助于系統而全面地解析基因功能。轉錄組分析可以檢測到不同物種或者不同時間與空間的遺傳表達差異，實現差異表達基因的信號通路富集分析。本研究檢測到與小鼠中年期和老年期睪丸組織轉錄組表達差異相關的 139 個信號通路，其中信號轉導、脂代謝、碳水化合物代謝、內分泌系統和神經系統等 5 個代謝通路涉及的差異表達基因較多，同時與癌癥和免疫學疾病相關的信號通路富集一些基因。有研究報道，在有參照轉錄組分析當中，一般認為 RPKM>1 的基因是表達的，本研究著重將差異表達基因中 RPKM>1 的進行分析，發現中年期和老年期小鼠睪丸組織在脂代謝、GnRH 信號通路、固醇類激素生成、TNF 信號通路、補體系統、胰島素和溶酶體相關等信號通路存在較大差異。本研究中涉及脂肪合成與代謝的有脂肪酸結合蛋白4( FABP4)、內皮脂肪酶(Lipg)、蠟樣脂褐質沉著癥神經元5( Cln5)和鞘磷脂磷酸二酯酶1酸性溶酶體( Smpd1)。 FABP4 在脂肪、卵巢和睪丸組織中廣泛分布，能結合多種疏水性化合物，參與脂肪酸的合成[18]，該基因的缺失可增加脂肪酸濃度，促使脂肪分解[19]。本研究中發現年小鼠睪丸組織中 FABP4 的表達水平高于老年小鼠，說明睪丸組織隨著年齡的增加脂肪分解能力提高，貯存脂肪能力減少，為激素合成與精子生成提供的能量就不足。Lipg在內皮細胞合成，冠狀動脈、肝臟、肺、睪丸、腎臟和卵巢多種組織中表達，主要功能是參與脂蛋白代謝，其磷脂酶活性強于甘油三酯酶，對富含磷脂的高密度脂蛋白的水解作用更強，在動物試驗和人體內均發現內皮脂酶的水平與高密度脂蛋白(HDL-C)的水平呈負相關[20]。也有研究發現Lipg與炎癥反應也有密切的聯系，可促進細胞間黏附因子1的表達及單核細胞對血管內皮粘的附作用，這都與老齡化有密切的關系。本研究在小鼠中年期和老年期均檢測到該基因表達，且老年小鼠睪丸組織中Lipg基因表達水平顯著高于中年小鼠，結果與其組織器官的研究基本一致。

睪丸雄激素的合成由下丘腦分泌的 GnRH 調節，其通過促進垂體分泌促性腺物質影響性激素生成而影響雄性動物生殖活動[21]。本研究中 GnRH 信號通路和 TNF 信號通路涉及基質金屬蛋白酶(MMP-14)，睪丸組織中老年鼠要顯著高于中年鼠，有研究報道 MMP-14 異常表達與多種惡性腫瘤密切相關[22-23]，說明老齡化可增加患惡性腫瘤的風險。前列腺素D合成酶(Prostaglandin D synthase，PGDS)催化不穩定的中間產物前列腺素 H2(PGH2) 發生異構化生成，其分為腦型脂質運載蛋白 PGDS(lipocalin-PGDS，LPGDS) 和生血型 PGDS(hematopoietic PGDS，hPGDS)[24]。LPGDS在中樞神經系統、雄性生殖器官和心臟等組織分布，具有轉運親脂性物質和催化 PGD2 合成的雙重功能，在腦脊液、精漿及血漿內都可檢測到[25-26]。關于LPGDS如何影響雄性生殖能力的研究還沒有清楚解析，但推測其攜帶腎上腺素、類固醇、維生素A等越過血-睪屏障幫助精子細生成與成熟。本研究中LPGDS基因在老年期小鼠睪丸組織的表達水平顯著高于中年期，可以作為其功能研究的一個切入點。此外，補體系統、胰島素、溶酶體、氨基酸代謝和嗅覺轉導系統等檢測到一些差異表達基因，其在睪丸生理生殖活動中的作用還需進一步研究。

本研究對中年期和老年期小鼠睪丸組織進行轉錄組分析，檢測小鼠睪丸組織不同年齡階段基因表達的差異及相關的信號通路。該研究為豐富小鼠睪丸組織轉錄組信息提供中老年期的數據，也為探討睪丸功能退化及其在老齡化過程中生物學與醫學等某些方面的研究奠定基礎。