含油廢水中篩選的兩種石油降解菌的鑒定及降解效果

劉 虹，高鵬飛，叢唯一，王明超，溫 鋼，田 朕

(1.吉林化工學院 資源與環境工程學院，吉林 吉林 132022；2.吉林省環境科學研究院，吉林 長春 130012；3.吉林化工學院 生物與食品工程學院，吉林 吉林 132022)

當今，石油對土壤、水和其他自然資源的泄漏備受關注，石油污染對人類和生態系統來說是一個嚴重而且日益嚴重的問題.為了解決這一環境問題，應用適當的微生物技術是對有害污染物生物降解的最佳途徑之一，微生物技術即利用微生物的代謝活動來降解污染物，減少或最終消除污染的過程[1，2].這種方法也是最有前途的方法之一，通過這種有效和環保的方式來減少污染，既能降低石油烴在生產、運輸、消費過程中對公眾健康和自然資源產生的危害，而且成本低又能減少二次污染[3，4].石油烴是一種復雜的混合物，含有各種烴類主要有烷烴類：正烷烴、支鏈烷烴，芳香烴，脂環烴和不飽和烴等[5].在實際石油烴污染環境的微生物修復中，不同種屬的微生物對石油烴的降解能力不同，且降解的石油烴的成分也不盡相同.目前，已報道能降解石油的微生物包括細菌、放線菌、霉菌、酵母及藻類,其中以細菌種類最多[6],石油烴降解細菌主要有假單胞菌[7]、無色桿菌[8]、枯草芽孢桿菌[9]、炭疽桿菌[10]、綠膿桿菌[11]等.對總石油烴效果降解大多在50%～90%間.

目前研究中關于蒼白桿菌與粘質沙雷氏菌及其與其他混合菌對總石油烴的降解研究較少，相關報道[12，13]，粘質沙雷氏菌對染料廢水處理的好氧需氧階段及促進植物生長有積極作用，主要用于藥物如紅霉素的降解及對除草劑如麥草畏的降解研究[14].本研究對煉油廢水中篩選出的2種菌進行生理生化試驗、16S rDNA 堿基序列分析及系統發育分類鑒定，并研究了蒼白桿菌和粘質沙雷氏菌對總石油烴的降解效果.為石油烴污染環境的微生物修復提供基礎數據和理論支持.

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗菌株

菌株來源：從含油廢水中篩選出降解石油烴的菌株，冷藏保存.

1.2 主要實驗試劑

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2.

無機鹽液體培養基(單位：mg/L)：(NH4)2SO42 000，K2HPO41 550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，FeSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH值7.0)：39 mL 0.2 mol/L NaH2PO4·2H2O溶液與61 mL 0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O溶液混勻即得.

1.3 主要儀器設備

LD4-2A醫用離心機、氣相色譜儀(Agilent7890B)、手提式壓力蒸汽滅菌器、SP-DJ系列垂直凈化工作臺HZQ-QX全溫振蕩器、JMS-6700F場發射掃描儀、PTC-200型PCR儀(美國)等.

1.4 總石油烴(簡稱TPH)測試分析方法

樣品TPH采用氣相色譜儀進行測定

色譜條件：[注入口SPL1]：注入方式：切片；溫度：280.0 ℃；載氣：氮氣/空氣；流量控制方式：壓力；壓力：59.5 kpa；流量總量：37.7 mL/min；柱箱流量：1.65 mL/min；線速度：30.9 cm/sec；清洗流量：3.0 mL/min；分流比：20.0；高壓力注入：關閉；載氣保存：關閉；分流器定位：關閉.[柱箱]：初始溫度：80.0 ℃；平衡時間：3.0 min；總程序時間：31.50 min.[柱箱信息]：柱箱名：Rtx-1；序列號:10124；薄膜厚度：0.25 mm；柱箱長度：30.0 m；內徑：0.32 mm ID；柱箱最大溫度：330 ℃.[檢測器通道1 DFID1]：溫度：290.0 ℃；信號采集：是；采樣速率：40 msec；停止時間：31.00 min；延遲時間：0.00 min；極性：+進樣體積：1.0 μL.

2 實驗方法

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 生理生化試驗

分別對L2與L3菌株進行需氧性試驗、產氨試驗、甲基紅試驗、V.P試驗、淀粉水解試驗、接觸酶試驗、明膠液化試驗、油脂水解試驗、苯丙氨酸脫氨酶9項生理生化試驗.

2.1.2 16SrDNA的擴增與測序

16SrDNA基因的PCR擴增引物：上游引物7F：5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物1540R：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’.

PCR擴增條件：96 ℃預變性1 min，96 ℃變性10 sec，50 ℃退火5 sec，60 ℃延伸4 min，共進行25個循環，最后4 ℃保溫.取5 μL反應液與1 μL 6×上樣緩沖液混合，在1%的瓊脂糖凝膠中，于150 V電壓下電泳檢測.

引物合成及PCR產物測序由上海生工生物工程技術有限公司完成.

2.2 菌株降解石油烴效果、

取13個150 mL錐形瓶中分別加入50 mL無機鹽培養液、200 mg 0#石油.其中1個不加菌作為空白對照，其余12個樣品每6個分別加入5 mL同種石油烴降解菌溶液在600 nm波長處的吸光度(OD600)約為0.6于120 r/min、30 ℃下振蕩培養6 d.每組實驗設置2組平行樣.每隔1 d取兩個不同菌株樣品，加入10 mL正己烷進行萃取.萃取后的有機相經無水硫酸鈉干燥后用GC氣相色譜儀測定TPH殘留量，計算其降解率.TPH降解率公式見式(1)：

(1)

式中：η為TPH降解率，100%；C0為空白對照的石油烴質量濃度，mg/L，C1為降解后的石油烴質量濃度.

3 結果與討論

3.1 菌體生理生化試驗特性及分子鑒定

3.1.1 生理生化特性

對L2、L3菌進行了9項生理生化試驗，測試結果如表1所示.

表1 菌株生理生化試驗結果

注：+陽性，-陰性

3.1.2 菌株分子系統發育分析

將菌株16S rDNA序列輸入Gen Bank數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，以BLAST軟件進行序列同源性比較，選擇同源性大于98%的基因序列，采用Bioedit和MEGA5.0軟件對L2、L3進行系統發育分析，用Neighbor-joining法構建系統發育樹，500次重復檢測，計算自引導值(Bootstrap)以估計系統進化樹的置信度.結果如圖1、圖2所示.

圖1 L2菌基于16S rDNA序列的系統發育樹

圖2 L3菌基于16S rDNA序列的系統發育樹

由圖1可知：L2菌與Ochrobactrum ciceri(Ca-34)進化距離較近，結合生理生化特性，判定L2菌株在分類學屬性為：蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri).由圖2可知：L3菌與serratia marcescens NBRC 202204進化距離較近，結合生理生化特性，判定L3菌株在分類學屬性為：粘質沙雷氏菌(serratia marcescens).

相關研究還發現，菌株蒼白桿菌可以利用玉米秸稈水解液中的生物聚合物不需要另外過量的磷酸鹽，可大大降低微生物絮凝劑的生產成本[15].粘質沙雷氏菌經過144 h，對o-DCB的去除率可達90.41%，當Cr(VI)初始濃度低于40 mg/L時，菌株對Cr(VI)的去除率超過80%；而當Cr(VI)初始濃度高于40 mg/L時，菌株對Cr(VI)的去除率接近20%.對復合污染物同時具有去除作用[16].粘質沙雷氏菌還能發酵生產2，3-丁二醇在3.7 L發酵罐中進行補料發酵實驗,在42 h 2,3-丁二醇濃度可達151 g/L,生產能力為3.59 g/L·h,產物得率為94.97%[17].目前，關于蒼白桿菌和粘質沙雷氏菌降解石油在國內鮮有報道，因而，本文鑒定并研究兩種菌株降解石油烴效果拓寬了降解石油烴菌株的種類.

3.2 兩種菌珠菌株對石油烴降解效果對比圖

初始石油烴濃度為4 000 mg/L時，L2、L3菌株對石油烴的降解率隨時間變化如圖3所示.

t/d圖3 2種菌株對石油烴的降解率曲線

由圖3可知：由于菌株的生長關系，2種菌株對石油烴的降解率在初始的2天處于對數期菌株以石油烴類為唯一碳源，菌株生長較快，酶活性也較高，增加較快，因此，對石油烴的降解率高.而3 d后菌株生長較為緩慢，因而，降解能力逐漸降低.6 d后，L2與L3 2種菌株對石油烴的降解率分別達到97.37%和98.98%.說明2種單菌對石油烴污染環境具有很強的生物修復潛力.

3.3 兩種菌株降解石油烴氣相色譜圖

將空白組和各單菌降解石油烴6d后的樣品進行氣相色譜測定后，所得空白對照和L2、L3菌降解后的石油烴樣品測定結果如圖4，圖5和圖6所示.

t/min圖4 石油烴氣相色譜圖(未降解前)

t/min圖5 L2菌對石油烴降解6 d后氣相色譜圖

t/min圖6 L3菌對石油烴降解6 d后氣相色譜圖

從圖4、圖5和圖6可以看出L2、L3菌株對石油烴降解效果非常明顯.石油其主要成分是碳氫構成的烴類化合物，烷烴、環烷烴、芳香烴約占石油成分的95%以上，絕大部分均可被微生物代謝降解[18，19].不同菌屬的微生物對石油的降解能力也不同，石油烴本身性質也會對降解產生影響.一般認為，不同烴類化合物的降解率如下：小于C10的直鏈烷烴>C10-C24或更長的直鏈烷烴>小于C10的支鏈烷烴>C10-C24或更長的支鏈烷烴>單環芳烴>多環芳烴>雜環芳烴.低硫、高飽和烴的粗油最易降解，而高硫、高芳香族烴類化合物的純油則最難降解[20].烷烴的降解途徑主要有單一末端氧化、雙末端氧化或ω-氧化、次末端氧化3種方式.上述兩種高效石油烴降解菌株為其在石油烴污染環境的生物修復方面提供了新的參考理論依據.

4 結 論

采用16S rDNA技術對煉油廢水中篩選出的2種菌進行鑒定，經生理生化特性及16S rDNA鑒定2種菌在分類學上L2、L3分別屬于蒼白桿菌(Ochrobactrum ciceri sp.)和粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens sp.).

將2種菌株用于石油烴降解，初始濃度為4 000 mg/L的石油，加入該菌株，120 r/min、30 ℃下振蕩培養6 d后石油烴降解率高達97.37%和98.98%.