基于多巴胺-氧化石墨烯復合物的攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜法測定食用油中黃曲霉毒素

李珺沬，律 濤，劉 彥，李 程，王新宇，馬海燕

(河北醫科大學 藥學院，河北 石家莊 050017)

黃曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是黃曲霉和寄生曲霉產生的次生代謝產物[1]，是一種劇毒物質，被世界衛生組織(WTO)的癌癥研究機構(IARC)劃定為天然存在的Ⅰ類致癌物[2]。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2(AFB1、AFB2、AFG1和AFG2)(分子結構式如圖1)普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中[3]，然而，由于AF化學結構極其穩定，普通的食物處理方法很難將其消除[4]，所以一旦AF進入人類食物鏈，即對人體健康造成極大的危害。目前，全世界每年約有25%的食物可能受到AF的污染[5]，尤其用于食用油生產的主要原料花生、葵花籽、大豆、芝麻等，在貯藏、運輸、生產和加工等各環節均易受到黃曲霉菌侵染[6-7]，導致AF中毒事件屢見報道[8]，而食用油中AF的檢測方法研究卻非常有限。因此，研究建立食用油中AF的檢測方法對于保障食品安全具有重要意義。

目前，AF的檢測方法主要有薄層色譜法[9]、熒光分光光度法[10]、酶聯免疫法[11-14]、免疫親和柱凈化/高效液相色譜法[15-18]等。然而薄層色譜法的特異性差、靈敏度低；熒光分光光度法只能檢測AF總量，不能實現AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的單獨測定;酶聯免疫法的特異性強、分析速度快，但穩定性較差，假陽性較多；而免疫親和柱法依賴于與抗體的結合，可能產生抗體交聯反應，導致測定結果不準確。

石墨烯是碳原子以SP2雜化軌道組成的具六角型蜂巢晶格結構的二維納米材料[19]，可經氧化制得具有含氧官能團的氧化石墨烯[20-21]。氧化石墨烯表面上的官能團能與不同的試劑反應得到功能化石墨烯，其可作為優越的吸附材料用于樣品的前處理研究[22-25]。近年來，受貽貝足絲蛋白5(Mfp-5)超強黏附特性的啟發，貽貝仿生化學也逐漸成為材料學、化學和生物醫學等領域的研究熱點[26]。多巴胺可作為Mfp-5的模型分子，通過復雜的氧化-自聚和組裝，黏附于有機或無機固體材料表面，并能夠通過化學鍵的作用與吸附材料形成聚多巴胺-吸附材料復合物涂層，從而為吸附材料在樣品前處理領域的研究開辟了更加廣闊的前景[26-27]。

本研究基于貽貝仿生化學制備多巴胺-氧化石墨烯復合物固相萃取材料，并將其鍵合在含有磁子的聚四氟乙烯材質的攪拌棒上，利用攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜/熒光檢測器對食用油中的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2進行分析。該方法具有高效、靈敏、重現性好等特點，為食用油中痕量AF的分析提供了有效手段。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

L-6200A高效液相色譜儀(日本Hitachi公司)；2475熒光檢測器(美國Waters公司)；柱后衍生系統(北京創新通恒科技有限公司)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌水浴鍋(鞏義市科華儀器設備有限公司)；HGC-24型氮吹儀(天津恒高技術有限公司)。

AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準溶液(美國Sigma公司)；氧化石墨烯水分散液(濟寧利特納米技術有限責任公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Tedia Scientific公司)；鹽酸多巴胺(山東西亞化學工業有限公司)；碘(濟南蕭試化工有限公司)；所用其它試劑均為分析純，實驗用超純水由美國Millipore公司Milli-Q純水系統制備。

實驗所用食用油購自石家莊市某市場。

1.2 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18色譜柱(5 μm，250 mm × 4.60 mm)；流動相：甲醇-乙腈-水(10%磷酸調至pH 3.5，體積比3∶ 3∶ 5)；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL；流速：0.8 mL/min；熒光檢測：λex=360 nm，λem=450 nm；衍生溶液：0.05%碘溶液；衍生試劑流速：0.3 mL/min；衍生溫度：70 ℃。

1.3 混合標準溶液的配制

分別精密量取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2標準溶液適量于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2均為50 μg/L的混合標準儲備液。將混合標準儲備液用甲醇逐級稀釋，配制成含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別為10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/L的系列混合標準溶液，于4 ℃避光保存。

1.4 SBSE攪拌棒的制備及表征方法

將含磁子的攪拌棒置于含2 g/L多巴胺的Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)中，于30 ℃磁力攪拌水浴鍋中緩慢勻速攪拌12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min，將攪拌棒置于2 g/L氧化石墨烯水分散液中，于65 ℃磁力攪拌水浴鍋中反應12 h，取出攪拌棒，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥30 min。重復以上實驗步驟3次，得到具有一定多巴胺-氧化石墨烯復合物涂層厚度的SBSE攪拌棒，該攪拌棒能夠批量制備，每個攪拌棒可重復使用20次。

應用掃描電鏡對SBSE攪拌棒上的涂層進行表征。將上述已涂層的SBSE攪拌棒置于甲醇中超聲清洗30 s，于60 ℃恒溫干燥箱中干燥2 h，取出，采用離子噴鍍儀進行金離子鍍膜，于掃描電子顯微鏡下觀察，對SBSE攪拌棒涂層效果進行表征。

1.5 樣品前處理方法

精密量取食用油樣品1 mL于10 mL離心管中，加入甲醇-水(7∶ 3)溶液[28]5 mL，超聲提取10 min，以3 500 r/min離心5 min，精密量取上清液3 mL于西林瓶中，用水稀釋至10 mL。

將制備好的攪拌棒置于上述溶液中，在磁力攪拌水浴鍋中于50 ℃ 300 r/min萃取20 min，取出，于1 mL解吸溶劑甲醇中洗脫10 min，解吸溶液于45 ℃氮氣流下吹干，以0.1 mL流動相復溶，作為供試品溶液。

2 結果與討論

2.1 SBSE攪拌棒涂層效果的表征

通過掃描電鏡技術對SBSE攪拌棒的涂層效果進行表征。由圖2可見：未經涂層的SBSE攪拌棒表面光滑(圖2A及插圖)，經多巴胺-氧化石墨烯復合物涂層后的SBSE攪拌棒表面呈粗糙、褶皺形態(圖2B及插圖)，這種攪拌棒表面由光滑到粗糙、褶皺現象的變化是由于多巴胺聚合氧化石墨烯后能夠形成高度交聯的多孔性結構所致。實驗結果還表明，多巴胺-氧化石墨烯復合物已成功聚合到攪拌棒上，形成了多巴胺-氧化石墨烯復合物涂層的SBSE攪拌棒。

2.2 樣品前處理條件的優化

2.2.1萃取溫度的優化考察了萃取溫度在30～70 ℃范圍時SBSE對AF萃取效果的影響。結果表明：隨著萃取溫度的升高，4種AF的峰面積逐漸增大，當溫度為50 ℃時萃取效果最佳，之后繼續提高萃取溫度，各待測組分的峰面積逐漸減小。因此，本實驗選擇最佳萃取溫度為50 ℃。

2.2.2攪拌速度的優化攪拌能夠加快溶液中待測組分的傳質速率，縮短萃取時間。本實驗考察了不同攪拌速度(100、200、300、400、500 r/min)對萃取效果的影響。結果表明，當攪拌速度為300 r/min時，各待測組分的峰面積最大，萃取效果最佳。因此，本實驗選擇最佳攪拌速度為300 r/min。

2.2.3萃取時間的優化考察了不同萃取時間(5、10、20、30、40 min)對萃取效果的影響。結果表明：隨著萃取時間的延長，各待測組分的峰面積逐漸增大，當萃取時間為20 min時，4種AF的峰面積達到最大值，之后繼續延長萃取時間，各待測組分的峰面積變化不明顯。因此，選擇最佳萃取時間為20 min。

2.2.4離子強度的優化考察了體系中加入不同質量分數(0、1%、2%、3%、4%)的NaCl對萃取效果的影響。結果表明，離子強度的變化對4種AF的萃取量有明顯影響，隨著NaCl加入量的增大，各待測組分的峰面積均呈下降趨勢。因此，本實驗選擇不添加NaCl。

2.2.5解吸時間的優化解吸時間是影響待測組分回收率的重要因素。本實驗考察了不同解吸時間(2、5、10、15、20 min)對萃取效果的影響。結果表明，隨著解吸時間的增加，4種AF的峰面積逐漸增大，當解吸時間達到10 min時，萃取效果最佳，之后繼續增加解吸時間，各待測組分的峰面積趨于平緩。因此，本實驗選擇最佳解吸時間為10 min。

2.3 方法評價

2.3.1線性關系、定量下限與檢出限按“1.2”色譜條件，對系列濃度的混合標準溶液進樣測定，以目標物的峰面積(y)對其質量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線，結果如表1所示。AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在0.200～10.0 μg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數r2≥ 0.998 9。取系列混合標準溶液的最低濃度溶液逐級稀釋，進樣并記錄色譜圖，分別以信噪比S/N=10和S/N=3計，得到該方法的定量下限(LOQ)和檢出限(LOD)分別為0.100～0.200 μg/L和0.025～0.050 μg/L(見表1)。

表1 4種AF的線性范圍、線性方程、定量下限、檢出限及相關系數Table 1 Linear ranges，linear equations，LOQs，LODs and correlation coefficients of 4 AFs

2.3.2回收率與精密度以土榨花生油為例，按“1.5”方法進行樣品前處理，分別向不含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的土榨花生油樣品中添加低、中、高(0.2、1、5 μg/L) 3個濃度水平的混合標準溶液適量，每組樣品平行實驗6次，連續測定6 d，結果如表2所示。4種AF的加標回收率為81.5%～96.9%，日內相對標準偏差(RSD)為1.7%～3.4%，日間RSD為1.9%～3.5%，表明該方法的準確度和精密度良好。

表2 4種AFs的平均回收率和精密度Table 2 Mean recoveries and precisions of 4 AFs

圖3 AFs混合標準溶液(A)、空白土榨花生油樣品(B)和含AFB1的土榨花生油樣品(C)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of AFs mixsture standards(A)，blank groundnut oil sample extracted by native method(B) and groundnut oil sample containing AFB1 extracted by native method(C)1.AFG2；2.AFG1；3.AFB2；4.AFB1

2.4 方法應用

采用該方法對市售5份花生油(其中2份為正規廠家生產，3份為榨油作坊生產)、5份葵花籽油、5份大豆油和5份芝麻油樣品進行檢測，色譜圖見圖3。結果表明：1份土榨花生油樣品檢出AFB1，檢出量為2.2 μg/kg，未超標[29]，其它樣品未檢出上述4種AFs。推測原因可能是由于AF對花生具有較高的親和性，在潮濕環境下更易受到AF污染；由于榨油作坊原料儲藏不當，在加工過程中未對重度污染的原料進行挑選剔除，因此AF的檢出率較高，而正規廠家的食用油由于采用標準化生產，因此產品質量能夠得到有效保障。

2.5 檢測方法的比較

考察了該方法與國標方法[28]的檢測結果差異，取不含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的同一土榨花生油樣品，分別向其中添加低、中、高(0.2、1、5 μg/L)3個濃度水平的適量混合標準溶液，在相同條件下，分別采用本方法與國標方法平行測定6次，計算回收率(表3)。結果表明，該方法與國標方法的回收率無顯著性差異(P>0.05)。

3 結 論

本研究基于貽貝仿生化學技術，以多巴胺-氧化石墨烯復合物為固相萃取材料制備攪拌棒，建立了攪拌棒吸附萃取/高效液相色譜檢測食用油中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的方法。自制的攪拌棒能夠批量制備、重復利用，從而大大提高了實驗效率；通過對SBSE條件進行考察，優化出最佳萃取條件，并將該方法應用于食用油中4種AF的測定，實驗結果表明，該方法具有操作簡單、靈敏度高、重現性好等特點，能夠滿足痕量AF的測定要求，為食用油中AF殘留的測定提供了方法參考。

表3 本方法與國標方法的實驗結果比對Table 3 Comparison results obtained from the presented method and the national standard method