固相萃取/高效液相色譜法對火龍果中手性苯醚甲環唑的分離測定

張利強，邢淑蓮，林麗云，林 玲，葉劍芝，楊春亮*

(1.中國熱帶農業科學院 農產品加工研究所，農業農村部農產品加工質量安全風險評估實驗室(湛江)，廣東 湛江 524002；2.中國熱帶農業科學院 湛江實驗站，廣東 湛江 524002)

物質與其鏡像不能重疊的性質稱為手性(Chirality)，是自然界普遍存在的基本屬性。由于生物體中許多生化反應在手性環境條件下發生，使得對映體雖具有相同的理化性質，但在毒性、生物活性及與手性的生命系統作用時常表現出明顯差異[1]。如20世紀60年代典型的“反應停事件”，沙利度胺(Thalidomide)的R-型對映體具有抑制妊娠反應活性，而S-型對映體具有嚴重的胚胎毒性和致畸作用[2]。三唑類手性農藥種類眾多且應用廣泛，但由于其對映體存在不同的殺菌活性和毒理效應而被美國環境保護署(EPA)列為潛在的手性致癌物[3-4]。因此，建立測定手性農藥對映體含量的新方法，對于明確對映體活性和毒理效應，客觀全面了解手性農藥在環境中的確切行為具有重要研究意義。

圖1 手性農藥苯醚甲環唑的化學結構Fig.1 Chemical structure of chiral pesticide difenoconazole*denoted chiral center

苯醚甲環唑4個手性對映體的拆分和測定與僅含1個手性中心的其他三唑類農藥相比難度較大。有關苯醚甲環唑等三唑類農藥對映體的拆分方法主要有毛細管電泳法[8-10]、超臨界流體色譜法[11-13]和高效液相色譜法[14-17]。液相色譜法因無需樣品氣化，柱容量高，分離條件溫和，且該儀器技術日趨成熟，已成為三唑類農藥手性拆分的主流方法[18]。上述儀器方法[8，13-15]對其他三唑類農藥均能實現較好的基線分離，而對苯醚甲環唑其中2個對映體(2R,4R)-苯醚甲環唑與(2S,4S)-苯醚甲環唑卻不能完全分離或分離時間較長[16]。本研究以火龍果為代表，建立了一種石墨化炭黑/氨基固相小柱凈化，直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)鍵合手性柱(IF-3)進行拆分的高效液相色譜法。該方法分離時間較短，分離效果好，靈敏度高。適合推廣用于火龍果等水果中手性農藥苯醚甲環唑含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器、自動進樣器(日本島津公司)；PL-602L電子天平(美國梅特勒-托利多公司)；24N-EVAP112型氮吹儀(美國Organomation公司)；MS-3振蕩器(德國IKA公司)；立式大容量高速離心機(日本日立公司)。

苯醚甲環唑外消旋體標準品(純度≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)；正己烷、丙酮、乙腈、乙醇(色譜純，德國默克公司)；氯化鈉(優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；Sep-Pak Carbon/NH2固相萃取柱(500 mg/500 mg，6 mL，美國Waters公司)；Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，填料為直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合3 μm硅膠(日本大賽璐化學工業公司)，其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。火龍果樣品從市場隨機購買。

1.2 實驗方法

1.2.1色譜條件手性色譜柱：Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，填料為直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)共價鍵合3 μm硅膠。流動相為正己烷-乙醇(92∶ 8，體積比)，使用前經0.45 μm濾膜過濾，手動搖勻。流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm，進樣量為60 μL。所有樣品至少平行測定2次。

1.2.2標準溶液的配制準確稱取25 mg苯醚甲環唑外消旋標準品于25 mL容量瓶中，用丙酮溶解并定容至刻度，得到1 000 mg/L的外消旋苯醚甲環唑儲備液，即對映體的質量濃度均為250 mg/L。于4 ℃冰箱中避光保存，臨用前恢復至室溫并搖勻。按樣品前處理過程將空白樣品處理后得到空白基質提取液，用此基質溶液將標準儲備液稀釋至所需濃度，得到一系列不同濃度的苯醚甲環唑基質標準溶液。

1.2.3樣品前處理方法選取新鮮的火龍果，帶皮切成小片，用打碎機磨成果漿。分別稱取火龍果試樣10.00 g于3個50 mL離心管中(1、2、3號)，1號離心管中不添加外消旋苯醚甲環唑標液作為空白；2號離心管中添加0.20 mL 20 mg/L的外消旋苯醚甲環唑標液作為樣品1；3號離心管中添加1.40 mL 20 mg/L的外消旋苯醚甲環唑標液作為樣品2。各離心管的液體混勻后作為模擬樣品，用于回收率實驗。

分別加入20.0 mL乙腈于上述離心管中，混勻，加入4.0 g氯化鈉，于2 000 r/min渦旋1 min，再以8 000 r/min離心5 min，吸取上層乙腈清液氮吹至約1 mL。用4.0 mL乙腈-甲苯(3∶ 1，體積比，下同)預先淋洗石墨化炭黑/氨基小柱，至液面近干時，將提取液加入到小柱中，再向濃縮管中加入2.0 mL乙腈-甲苯(3∶ 1)，渦旋后一并加入到小柱。然后用10.0 mL上述混合溶劑洗脫，洗脫液氮氣吹干，用正己烷定容至1.00 mL，過0.22 μm有機濾膜后待測。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1手性色譜柱的選擇目前關于苯醚甲環唑手性拆分的研究較少，文獻報道中采用的手性色譜柱有纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)(Chiralcel OD柱)[13，15]、纖維素-三(4-甲基苯基甲酸酯)(Chiralcel OJ柱)[15，17]和纖維素-(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)[7](Chiralcel IB-3柱)。根據前期實驗室數據和文獻資料，考察了Chiralcel OD柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)、Chiralcel OJ柱(4.6 mm×250 mm，3 μm)和Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)對苯醚甲環唑的拆分效果。結果顯示，(2R,4R)-苯醚甲環唑、(2S,4S)-苯醚甲環唑、(2R,4S)-苯醚甲環唑在OJ柱上完全分不開，在OD柱上未基線分離，且用時較長(超過50 min)，而在IF-3柱上，除(2R,4R)-苯醚甲環唑、(2S,4S)-苯醚甲環唑不能完全分離外，其他對映體均能實現完全分離，且用時較短。實驗最終選擇IF-3手性柱進行分離。

2.1.2流動相組成的優化分別配制體積比為90∶ 10、92∶ 8和95∶ 5的正己烷-乙醇3種流動相，考察了乙醇用量對分離效果的影響。4個對映體的保留時間和分離度見表1。結果表明，流動相中乙醇體積分數為10%時，洗脫速度最快；而乙醇體積分數為5%時雖分離度最好，但洗脫時間較長。為兼顧洗脫速度和分離度，選用正己烷-乙醇(92∶ 8)為流動相。

表1 不同流動相中苯醚甲環唑對映體的保留時間及分離度Table 1 Retention times and resolutions of difenoconazole enantiomers in different mobile phases

*number(1-4) denoted were(2R,4R)-difenoconazole，(2S,4S)-difenoconazole，(2R,4S)-difenoconazole and(2S,4R)-difenoconazole，respectively

2.1.3流速的選擇分別考察了流動相流速為0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min時對洗脫時間、柱前壓力和分離度的影響。實驗得到RS12分別為1.12、1.08、1.04、1.00，RS23分別為2.05、2.03、1.99、1.94；RS34分別為3.03、3.01、2.94、2.91。由于一針樣品所需時間取決于最后一個色譜峰，因此重點考察了(2S,4R)-苯醚甲環唑的保留時間，分別為37.31、27.90、24.60、20.93 min。柱前壓力分別為6.0、7.5、9.1、10.7 MPa。由于較大的柱前壓力會對色譜柱耐用性造成影響。因此綜合考慮分析時間、分離度和柱子損傷等因素，選擇流速為1.0 mL/min。

2.1.4進樣量的選擇分別考察了進樣量為20、30、40、50、60、70、80 μL時對分離效果的影響。結果顯示，4個對映體的響應值均隨進樣量的增大而增加，但分離度逐漸減小。綜合考慮響應值和前兩個對映體間的分離度，同時避免樣品量增加對色譜的污染，實驗最終選擇進樣量為60 μL。

圖2 外消旋苯醚甲環唑標準溶液的色譜圖Fig.2 Chromatogram of difenoconazole enantiomers peak number(1-4) were(2R,4R)-difenoconazole，(2S,4S)- difenoconazole，(2R,4S)-difenoconazole and (2S,4R)-difenoconazole，respectively

綜上，確定優化后的手性分離色譜條件為：手性色譜柱Chiralcel IF-3(4.6 mm×250 mm，3 μm)，流動相為正己烷-乙醇(92∶ 8)，流速為1.0 mL/min，進樣量為60 μL。在優化色譜條件下對苯醚甲環唑對映體進行拆分，可在35 min內實現基線分離(圖2)。

2.2 溶劑效應的考察

前期實驗發現，不同氮吹濃縮程度的上機液出峰質量存在明顯差別，因此考察了乙腈和正己烷分別作為復溶溶劑時對出峰質量的影響。結果表明，當乙腈作為復溶溶劑時，對檢測信號干擾較大，基線明顯不穩定，且苯醚甲環唑4個對映體的峰形展寬變差，前2個對映體不能完全分離；而正己烷作為復溶溶劑時基線平穩，雜峰較少，苯醚甲環唑4個對映體的峰形對稱尖銳，基本全部分離。因此，樣品檢測時需嚴格控制氮吹濃縮過程，以避免乙腈殘留對出峰質量的影響。

2.3 基質作用的考察

前期實驗結果顯示，基質標準中苯醚甲環唑對映體(10 mg/L)的峰形明顯好于試劑標準，因此對不同濃度標準溶液的基質作用進行了考察，試劑標準和基質標準溶液按“1.2.2”配制。結果顯示，當質量濃度較低時，試劑標準和基質標準中苯醚甲環唑4個對映體的峰形和峰面積基本相同；當試劑標準質量濃度增至20 mg/L時，柱子過載造成峰形變差，4個對映體無法分開，而基質標準溶液質量濃度即便增至40 mg/L，4個對映體仍能基本全部分離，且峰形對稱尖銳。因此在樣品測定時選擇基質標準溶液進行校準定量，以確保結果的準確性。

2.4 基質標準曲線的繪制

用空白樣品提取液適當稀釋外消旋苯醚甲環唑儲備液，使其質量濃度分別為0.40、1.0、4.0、10、40 mg/L，由于外消旋苯醚甲環唑標準溶液中4個對映體含量相同，各對映體的質量濃度分別為0.10、0.25、1.0、2.5、10 mg/L。將基質標準溶液按優化的色譜條件進行液相色譜分離測定。以峰面積(y)為縱坐標，苯醚甲環唑對映體的質量濃度(x，mg/L)為橫坐標，繪制標準曲線。經4個對映體單個標準溶液分別上機測定比對，確認出峰先后順序為：(2R,4R)-苯醚甲環唑、(2S,4S)-苯醚甲環唑、(2R,4S)-苯醚甲環唑、(2S,4R)-苯醚甲環唑。回歸方程分別為：(2R,4R)-苯醚甲環唑：y1=50 198x1+37 324，r1=0.999 5；(2S,4S)-苯醚甲環唑：y2=53 528x2+9 923，r2=0.999 5；(2R,4S)-苯醚甲環唑：y3=84 607x3+114 966，r3=0.998 7；(2S,4R)-苯醚甲環唑：y4=81 929x4+31 206，r4=0.999 4。

上述結果表明，苯醚甲環唑對映體在0.10～10 mg/L范圍內線性關系良好。按3倍信噪比(S/N=3)確定單個對映體的檢出限為0.025 mg/L。

表2 火龍果樣品中苯醚甲環唑的平均回收率與相對標準偏差(n=4)Table 2 Average recoveries and relative standard deviations for difenoconazole in dragon fruit sample(n=4)

2.5 回收率實驗

分別稱取10.00 g火龍果樣品3份，其中1份做空白，另2份添加不同量的苯醚甲環唑標準品，按“1.2.3”方法進行前處理后測定，平均回收率和相對標準偏差(RSD)見表2。以加標樣品信噪比S/N≥10時空白樣品的加標濃度確定方法的定量下限(LOQ)，得到LOQ為0.10 mg·kg-1(見表2)。結果顯示，該方法回收率較好，在0.4、2.8 mg/kg加標水平下，4個對映體的平均回收率分別為83.7%～99.3%和86.4%～91.6%，RSD分別為1.3%～7.2%和1.4%～3.1%。火龍果樣品空白和添加外消旋苯醚甲環唑標準溶液后的色譜圖見圖3。

3 結 論

本文利用直鏈淀粉-三(3-氯-4-甲基苯基氨基甲酸酯)鍵合手性柱(IF-3)實現了對手性農藥苯醚甲環唑對映體的拆分。通過優化分離條件，成功拆分了苯醚甲環唑4個對映體，并建立了快速測定火龍果中苯醚甲環唑對映體殘留量的新方法。該方法分離時間較短，分離效果好，靈敏度高，適用于火龍果等水果中手性農藥苯醚甲環唑含量的測定。