液相色譜-串聯質譜聯用技術檢測人尿中去氨加壓素及其在人尿中的消除研究

閆 寬，董 穎，徐友宣，馬艷華，張力思，楊志勇，馮飛飛

(國家體育總局反興奮劑中心，北京 100029)

圖1 去氨加壓素的分子結構式(MW=1 068.426 4)Fig.1 Molecular structural formula of desmopressin(MW=1 068.426 4)

去氨加壓素(1-Desamino-8-D-arginine-vasopressin)是人工合成的精加壓素(Vasopressin)類似物，其結構是將精加壓素1位的半胱氨酸以及8位的L-精氨酸分別換成β-巰基丙酸和D-精氨酸(圖1)。該藥物臨床常用于中樞性尿崩癥、遺尿癥、術中止血、預防出血及某些出血性疾病的治療，其主要原理為拮抗腎臟集尿管中的V2受體，增加細胞水分的再吸收以達到抗利尿的作用。由于其對血液具有一定的稀釋作用，世界反興奮劑機構(簡稱WADA)于2012年將去氨加壓素列入禁用清單中的掩蔽劑類禁用物質[1-5]。

由于去氨加壓素為小肽類藥物，且易溶于水，因此無法使用液-液萃取等常規前處理方式，直接進樣的檢測方法又暫時無法達到WADA對該藥物的檢測限，因此檢測去氨加壓素的前處理方式只能使用固相萃取[6-8]。固相萃取是世界各國實驗室對于小肽類藥物檢測的主流方法，但文獻報道的前處理步驟較復雜且檢測儀器價格昂貴[9-11]。Esposito等[10-11]采用去脂、過夜冷凍干燥等前處理手段降低尿液帶來的基質干擾，提高去氨加壓素的分辨率，并使用了熱電公司的QE儀器確保靈敏度在pg/mL級別，該方法靈敏度很高，適合小批量樣品的定性定量，但無法實現短時間內大批量樣品的檢測，且儀器昂貴。國內尚無從人尿液中檢測該藥物的報道[12-13]。因此建立一種快速、價廉、高通量檢測該藥物的方法十分必要。同時文獻中提到可在3種服藥方式(口服、注射、鼻內)后2 h的尿液樣品中檢出去氨加壓素原型，但也僅限對受試后留取的樣品進行定性實驗，且國內外暫無對服用去氨加壓素后體內消除情況的報道[12-13]。因此，檢測并研究志愿者受試后留取的尿液樣本，可以明確該藥物的檢測窗口期，為興奮劑檢測工作提供一定的參考信息。

本文在前人研究的基礎上，對樣品前處理進行了改進，減少了前處理時間，實驗得到的檢出限能夠達到WADA對于實驗室檢測的技術要求，可在不漏檢的情況下提高工作效率。首次完成了受試后較長時間內陽性樣品的檢測，將可檢測窗口期增至10 h左右，最高可達到13 h，增強了實際檢測的效果和必要性，并可為興奮劑檢查工作提供一定依據和幫助，同時采用LC-MS/MS檢測并繪制了去氨加壓素代謝產物在人體內的代謝曲線，加深了對去氨加壓素在體內代謝和消除的理解。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290/6460C液相色譜-串聯四極桿質譜儀(美國安捷倫科技公司)；GENIE VORTEX-2 旋渦混合器(美國Scientific Industries公司)；Mettler PM200電子天平(感量0.001 g，德國IKA公司)；Milli-Q 超純水系統(美國Millipore公司)；TECHNE(Dri-Block DB-3D)氮氣干燥儀(英國Bibby公司)。

甲醇(美國Fisher Scientific公司)，異丙醇、甲酸、乙腈、甲基叔丁基醚(美國Dikma科技有限公司)，甲酸銨(瑞士Fluka分析試劑公司)，乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)，上述試劑均為色譜純；氨水(北京化工廠)、磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。液相色譜柱：Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm,美國Phenomenex公司)；固相萃取柱：Sep-Pak Vac 6cc C18-500 mg(Waters中國有限公司)；尖底進樣瓶(美國Wheaton公司)；螺口進樣瓶、螺口瓶蓋、鉗口進樣瓶、鉗口瓶蓋(美國安捷倫儀器公司)；2 mL及 5 mL 低吸附試管(德國Eppendorf公司)。

采用內標法進行定量。去氨加壓素的標準品與用作內標的去氨加壓素類似物(DEAMINO-CYS1,VAL4,D-ARG8)-VASOPRESSIN均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司，純度≥98%。

用于志愿者受試的藥品名為醋酸去氨加壓素片，為輝凌(瑞士)制藥有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品前處理使用3 mL甲醇對C18固相萃取柱進行活化后，加入2 mL磷酸鹽緩沖液(用氨水調至pH 8.5)進行淋洗，將2 mL待測尿樣加入SPE柱，控制載樣流速小于1 mL/min，待樣品過柱充分后用3 mL純水對SPE柱進行淋洗，隨后用3 mL體積比為80∶ 20的乙腈-乙酸乙酯(含5%甲酸)混合溶液洗脫，盡量吹干固相萃取柱并收集洗脫液，將洗脫液經氮氣吹干(40 ℃)后，加入初始流動相并定容至200 μL，采用LC-MS/MS進行分析。由于去氨加壓素為小肽類物質，在前處理過程中用低吸附試管以降低對該物質回收率的影響。

1.2.2色譜條件色譜柱：Phenomenex Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm);流動相：A為10 mmol/L甲酸銨水溶液(用甲酸調至pH 3.5)，B為乙腈。洗脫梯度：0～10 min，10%～90% B，10～12 min，90%B;平衡時間：3 min。流速：0.4 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：10 μL。

1.2.3質譜條件離子源：電噴霧離子源；離子采集模式：正離子；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：10 L/min；霧化氣壓力：20 psi；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流量：12 L/min。

1.3 去氨加壓素的代謝實驗

8名健康志愿者(4男4女)，年齡在23～25歲之間。留取空白尿后，服用0.2 mg醋酸去氨加壓素片，留取受試后第1 d的全部尿樣，及后3 d每隔12 h采集1次的陽性尿樣。所有尿樣均立刻于-20 ℃冰箱中冷凍保存。使用優化后的前處理方法對尿樣進行處理后上機檢測，基于實驗結果繪制原型物質代謝的曲線圖，以確定該物質的檢測窗口期。

圖2 去氨加壓素的子離子掃描圖Fig.2 The product ion scan result of desmopressin

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優化

根據化合物結構，選用ESI+電離模式對母離子進行全掃描，確定母離子，去氨加壓素由于其小肽的結構，更易產生雙電荷離子[M+2H]2+。使用SIM模式優化加速電壓以保證母離子的傳輸效率，使用子離子掃描模式打碎母離子，尋找合適的子離子碎片(圖2)。經過裂解規律的分析，選擇碎片m/z328.0、120.0為子離子，與文獻報道一致[9]。最后，使用MRM模式對選擇的診斷離子對進行碰撞能優化。表1為優化后的質譜參數。

表1 去氨加壓素及內標物的質譜參數Table 1 Mass parameters of desmopressin and IS

*quantitative ion

2.2 色譜條件的優化

由于去氨加壓素具有小肽類結構，且分子量大于1 000，可能導致色譜柱堵塞或快速老化，因此本實驗選擇分離大分子物質的專用填料一體柱Phenomenex Onyx Monolothic C18(100 mm× 2.0 mm)。相比于甲醇，有機相選擇乙腈可使目標物的響應和分離效果更理想，選擇pH 3.5的10 mmol/L甲酸銨水溶液為水相可提高離子化效率。實驗結果表明，去氨加壓素及內標物質的基線分離效果良好，峰寬均在0.2 min左右，去氨加壓素的保留時間約為2.7 min，內標物的保留時間為3.3 min左右(見圖3)。

2.3 前處理條件的優化

2.3.1緩沖液pH值的選擇根據不同比例配制不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)的緩沖液(用甲酸或氨水進行調整)，并考察了不同pH值下去氨加壓素的響應值(質量濃度為2 μg/L的加標尿樣)。結果顯示，由于去氨加壓素為堿性物質，采用pH 8.5的緩沖液時，其在SPE柱上的回收效果最佳。

2.3.2洗脫液的選擇在空白尿樣中添加相同濃度的藥物，分別以甲醇、異丙醇、乙腈、乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等常用有機溶劑(均含體積分數為5%的甲酸)為洗脫溶劑，對比了去氨加壓素在質譜中的響應強度。結果顯示，以乙酸乙酯為洗脫液時，去氨加壓素在質譜中的響應強度最大，回收效果最好，且信噪比最佳；乙腈的回收效果次之。將乙酸乙酯和乙腈按照一定比例混溶后作為洗脫溶劑，實驗結果顯示，當乙腈和乙酸乙酯的體積比為80∶ 20時(含5%甲酸)洗脫能力最好。實驗進一步考察了洗脫溶劑中不同甲酸含量(0%、5%、10%、15%)的影響，結果表明，甲酸為5%時的洗脫效果最佳。因此，實驗最終選擇體積比為80∶ 20的乙腈-乙酸乙酯(含5%甲酸)混合溶液作為洗脫液。

2.4 線性范圍及檢出限

配制不同質量濃度的去氨加壓素混合標準溶液(0.5、1、2、5、10、15、20 μg/L),在優化色譜條件下進行檢測,以去氨加壓素及內標的峰面積比(y)與質量濃度(x，μg/L)制作標準曲線,得到去氨加壓素的線性方程和相關系數(r2)，按照信噪比接近3計算該方法的檢出限(LOD)。結果表明，去氨加壓素的線性范圍為0.5～20 μg/L，線性方程為y=0.002 1x-0.595 5，r2=0.997 2，檢出限為0.2 μg/L。

2.5 回收率與相對標準偏差

使用10份不同空白尿樣分別配制去氨加壓素的加標水平為0.5、2、5 μg/L的尿樣，進行日內精密度實驗；再用6份不同空白尿樣分別配制上述3個水平的去氨加壓素加標尿樣，進行日間精密度、提取回收率及基質效應實驗，結果見表2。在低、中、高3個水平下的日內、日間相對標準偏差(RSD)均小于10%，提取回收率均高于59%，基質效應為83.2%～121.3%。表明實驗存在一定的基質增強或抑制效應，但基本控制在±20%內，符合WADA對基質效應的一般要求，可以滿足尿樣中去氨加壓素的檢測要求。

表2 去氨加壓素的相對標準偏差、回收率及基質效應Table 2 RSDs,recoveries and matrix effects of desmopressin

2.6 實際樣品檢測

采用本方法測定了8位志愿者受試后0～24 h內的陽性尿樣，并將結果與空白尿及配制的加標樣品進行對比。圖4分別為添加了0.5 μg/L的對照樣品、某位志愿者受試前的空白樣品及其服藥后2 h左右留取的陽性樣品的藥物檢測情況。

圖5 志愿者服藥后留取的尿樣中去氨加壓素的檢測濃度Fig.5 Desmopressin concentration after volunteers took the drug

圖5顯示了8名志愿者服藥前后尿樣中去氨加壓素原型代謝的檢測濃度，最高檢出質量濃度達2.4 μg/L，最長可檢測時間達到服藥后800 min(約13 h)，去氨加壓素在尿中濃度達到峰值的平均時間在服藥后70～150 min。相比于已有文獻報道，本研究首次采用LC-MS/MS檢測人體服用去氨加壓素后的原型代謝情況并繪制代謝曲線；同時明確了去氨加壓素在人體內的代謝峰值時間；且相比其他報道僅在服藥后120 min(2 h)收集的尿液樣品中檢出去氨加壓素原型，本研究在服藥后最長800 min之后(約13 h左右)仍可檢出藥物原型。詳細數據見表3。

表3 8位志愿者服藥后尿樣中去氨加壓素的檢測數據Table 3 Analysis data of desmopressin from 8 volunteers positive urine

M:male;F:female

3 結 論

本研究建立并優化了對檢測去氨加壓素具有專屬性和有效性的檢測方法，在保證一定回收率，滿足WADA對該物質檢出限要求的同時，縮短了前處理時間。后續實驗證明該方法可從陽性尿樣中檢測出去氨加壓素，同時，根據檢測多人服藥后留取的陽性尿，繪制并明確了單次服用該藥物在人體內的消除情況，并確定了檢測窗口期。本方法簡便，通用性廣，檢測成本低，且相比已有文獻將去氨加壓素的檢測窗口期延長至服藥后800 min，提升了檢測能力，為興奮劑檢查部門提供了數據參考。