腫瘤干細胞的研究進展

馬步鵬，陳曉波，吳志宏

（1中國醫學科學院北京協和醫院中心實驗室，2中國醫學科學院北京協和醫學院，3中國醫學科學院北京協和醫院骨科，4中國再生醫學國際集團，北京100730）

1 腫瘤干細胞概述

在對白血病的研究過程中，研究人員提出并逐步證實了腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）理論。在1937年，Furth等［1］將白血病小鼠的細胞種植到同系正常小鼠內，并發現約5%的移植實驗能夠成功。1963年，Bruce等［2］首次在體內對具有克隆形成能力的淋巴瘤細胞的比例進行定量檢測，顯示大約1%的移植細胞具有克隆形成能力。1997年，Bonnet等［3］從白血病患者體內分離出一類表面標志為CD34＋CD38－的細胞，此類細胞具有明顯的增殖分化、自我更新能力，可在非肥胖型糖尿病／重癥聯合免疫缺陷（non?obese diabetes／serve combined immunodeficiency，NOD／SCID）小鼠體內形成白血病。而其它類型的白血病細胞不能在NOD／SCID小鼠體內長出腫瘤。因此，這證實了白血病干細胞（leukemia stem cell，LSC）的存在，并明確地提出了“白血病干細胞”的概念。

在此之后，在實體腫瘤中，如乳腺癌［4］、腦瘤［5］、結腸癌［6］、胰腺癌［7］、惡性黑色素瘤［8］、肝癌［9］、肺癌［10］、前列腺癌［11］和卵巢癌［12］、胃癌［13］等，相繼成功分離出了CSC。

CSC具有以下幾個特點。（1）無限的自我更新能力：CSC能夠產生與親代完全相同的子代細胞，并通過自我更新維持著腫瘤的持續生長。（2）分化潛能：CSC能夠產生不同分化的子代瘤細胞。（3）高致瘤性，即很少量的CSC即能在體外培養生成集落，很少量的CSC注入實驗動物體內即可形成腫瘤，而一般腫瘤細胞形成腫瘤非常困難，或需要大量細胞。（4）耐藥性，CSC具有耐藥性有幾個原因：①多數CSC處于靜止或休眠狀態，不處在細胞的分裂期；②CSC膜上多數表達 ATP?binding cassette（ABC）家族膜轉運蛋白，這類蛋白大多可運輸并外排包括代謝產物、藥物、毒性物質、內源性脂類物質、多肽、核苷酸及固醇類等多種物質，使之對許多化療藥物產生耐藥。③CSC的DNA修復能力非常強大。目前認為CSC的存在是導致腫瘤化療和放療失敗的主要原因［15］。

2 CSC的研究進展

在過去的幾年中，CSC研究領域的重點已從利用培養的腫瘤細胞系的研究轉移到利用新鮮分離的腫瘤樣本和早期代數腫瘤細胞的異種移植的研究。越來越多的學者認識到異種移植實驗是評價CSC存在的關鍵［16］。這里，我們綜述這一快速發展領域內的幾個方面的近期進展情況，包括CSC的各種不同表型、個體腫瘤中存在的多個CSC群、CSC的遺傳進化能力、非腫瘤干細胞（non?CSC）轉化成 CSC的潛力等。這些研究結果突顯出了CSC的動態本質。

2．1 CSC的不同表型 CSC必須通過異種移植而非單獨通過免疫學表型來進行功能上的界定。許多免疫標記分子已被證實可用于標記從多種白血病和實體瘤中分離富含CSC的細胞亞群，這些標記分子包括 CD133、CD44、EpCAM、ALDH 等（表 1）［17］。 如，對白血病而言，CD34、CD38和IL3Ra的組合可有效分離出潛在的LSC。但必須指出的是，這些標記并非完全為LSC所特有。

表1 鑒定和富集血液腫瘤和實體瘤CSC的常用免疫標記分子

越來越多的證據表明：即使腫瘤屬于同一亞型，不同患者的干細胞表型也不相同。如在原發性膠質母細胞瘤中，CD133、SSEA?1／CD15／LewisX、CD133／α6?整合素均被證實可作為 CSC 的標記分子［18－20］；在乳腺癌中，盡管CD44和CD24已經廣泛用于分離CSC，但在 ER?陰性和triple陰性的乳腺癌中，CD44和CD24并無法選擇性地富集 CSC，因為在CD44＋CD24?和 CD44＋CD24＋細胞群體中均發現 CSC 的存在［21］。 同時，分別用 ALDHhi和 CD44hiCD24lo富集的同一乳腺癌的干細胞群體幾乎沒有重疊［22］。類似的現象也出現在直腸癌中，EPCAMhiCD44＋的CSC亞群和 CD133＋亞群僅有很小部分重疊［23］。

同一腫瘤類型來源的干細胞表型之間有限重疊反映了多個CSC群的存在。這種有限重疊或者是由所用技術的不同所致：如酶解條件的不同；使用培養過的細胞或者原代分選的細胞；多次傳代的細胞或早期傳代細胞等。另一個干擾因素為是否進行嚴格的連續異種移植以驗證CSC的自我更新能力。

盡管如此，不同標記的組合仍可以提高分離CSC的效率。例如，CD44的表達結合酪氨酸激酶受體c?Met的高水平表達提供了胰腺癌干細胞的強有力的選擇［24］；ALDH高表達再結合CD133的表達可富集卵巢癌干細胞［25］。

2．2 腫瘤內CSC的高度可變比例 由于異種移植，生長因子及其受體的種屬差異以及免疫識別的水平，大多數人類腫瘤中CSC的真實比例可能被低估。然而在很多實體腫瘤中，即使在更寬容的條件下測定其比例，CSC 的含量仍舊很低［26－27］。 CSC 在漿液性卵巢癌中比例非常低（＜0．04%），并且不同患者的差異非常明顯［26］。與之類似，在異種移植條件下對LSC的評估表明 LSC的比例范圍變化很大，為1 ／103～1／106［27］。

但是，CSC并非總是腫瘤細胞的一小部分。在特定的同系小鼠淋巴瘤和白血病模型中發現了較高比例的白血病干細胞，而在上皮性腫瘤和其他實體瘤的小鼠模型中，干細胞比例較低［28］。

“克里斯蒂娜，加油。”艾爾喊道，低沉的聲音出奇的大。她看著他。艾爾拍著手，大聲喊道，“加油，繼續抓住欄桿，加油，你可以做到的！抓住欄桿。”

雖然目前利用 NOD／SCID／IL2Rγnull小鼠來測定CSC的比例比之前利用NOD／SCID小鼠更為準確，但依然只能相對衡量小鼠體內CSC的比例［16］。理想的動物模型應準確地模擬人體內CSC的生存環境。

盡管如此，測定CSC的比例仍然是有實際意義的。CSC比例的增加通常意味著更高的侵襲能力［29－30］。

2．3 CSC 表型的不穩定性 已有報道［20，26］表明CSC的免疫分型在原發性腫瘤不同于其在異種移植腫瘤。大多數的原發漿液性卵巢癌包含CD133＋干細胞，而移植瘤中卻含大量 CD133－的CSC［26］。 原發腫瘤和異種移植腫瘤之間的這種差異提示遺傳學改變可促使腫瘤的發展，雖然這種差異不能排除由多種亞克隆的預先存在所致。這些數據不僅可以反映CSC的異質性，也提示CSC的表型在異種移植中可能無法穩定的傳代［26］。雖然在卵巢癌和乳腺癌的移植瘤中，干細胞頻率保持不變［20，26］，但已觀察到干細胞的比例在多次移植中有所增加，從而強調了CSC的不穩定性［25，29］，也提示了 non?CSC 向 CSC 轉化的可能性。

2．4 同一腫瘤中可以存在多個CSC群 腫瘤組織中可含有多個不同的CSC群。通過檢測CD34，CD38和／或IL3Ra的表達，發現了多個不同的LSC群。在大多數AML患者中，兩個不同的LSC群可以共存。這些群體更接近于正常祖細胞亞型，而非正常造血干細胞（hematopoietic stem cell， HSC），提示這些祖細胞異常地獲得了干細胞的某些特性［32］。通過對大量AML患者的研究［28，33］發現：在祖細胞和更原始的造血干細胞樣的組分中均包含LSC。這些現象表明在患者樣本中LSC存在很大的異質性。至少在一部分患者中，不同LSC亞群存在著層次關系。這些發現表明LSC可以去分化或者表型相互轉化。

同一腫瘤中存在多個CSC群現象的最可能的原因是原先的腫瘤（干）細胞獲得了新的突變或表觀遺傳學的改變，從而形成了一種新的CSC。在腫瘤細胞克隆進化等級模型中，早期體細胞突變（“主干枝”突變）傾向于在多個甚至全部克隆中發生，而后發突變僅在某些克隆中發生（“進化枝”突變）。發病機制相關的驅動突變往往發生于早期，而更混雜的進化枝突變可能賦予腫瘤的額外特征［34］。

2．5 腫瘤細胞的可塑性 腫瘤細胞的可塑性是指non?CSC可以轉化為CSC，即CSC和其分化的子代細胞間可能產生相互轉化。

特殊微環境中的生長因子或應激因素可以誘導某些分化的腫瘤細胞向CSC轉化。如腸癌中HGF可使non?CSC向CSC樣表型轉化［35］。由低氧微環境所誘導的HIF2a可以維持成膠質細胞瘤并促進非干細胞（CD133－）向干細胞樣細胞（CD133＋）轉化［36］。另外，正如間質細胞向上皮細胞轉化（mesenchymal?epithelial transition，MET）和上皮細胞向間質細胞轉化（epithelial?mesenchymal transition， EMT）的現象在胚胎發生過程中廣泛存在一樣，這一現象也存在于腫瘤的轉移過程中：上皮樣的腫瘤細胞（可能是non?CSC）可以在周圍環境的作用下（如 TGF?β 和Wnt信號），轉化為間質細胞（干細胞樣細胞），引發腫瘤轉移；（干細胞樣的）間質腫瘤細胞轉移至特定部位后，又轉化為上皮樣腫瘤細胞［37］。

non?CSC和CSC的雙向轉化并不包含于目前的CSC模型中。實際上，即使存在這種可塑性，依然不能削弱CSC的概念：在一個腫瘤細胞群體的任何時刻，依然存在表型和功能不同的CSC亞群和non?CSC亞群，不管是否存在中間類型的轉化細胞［38］。

但是，如果這種雙向轉化高頻率的存在，則CSC模型的意義大大縮減了：區分是否是CSC已經不重要了。 到目前為止的研究［35－38］表明，這種高頻率的雙向轉化并不存在，CSC以一種比較穩定的狀態存在，它們可以無限制地保持干細胞狀態；而且non?CSC向CSC的轉化，在大多數情況下，發生的概率很低，在某些腫瘤中，也許并不存在。這提示不同類型的腫瘤中non?CSC具有不同的轉化為干細胞的能力［38］。

盡管這種可塑性目前看來只是以較小的概率發生，但仍然會對腫瘤治療帶來巨大的影響。目前的腫瘤治療（放、化療）主要針對處于生長周期的分化的non?CSC，而不是CSC。因此，發展針對CSC的治療方案是非常必要和急需的。但是，如果non?CSC能夠轉化為CSC，則只針對CSC的治療方案也將是不完善的，因為存活的non?CSC依然可以轉化為CSC，從而導致腫瘤復發。因此，如果將來真正能治愈腫瘤的方案能夠實現，那么這種治療方案應該既針對CSC，又針對 non?CSC。

研究發現如果一個腫瘤的CSC比例越高，越容易出現轉移，預后越差，說明CSC與腫瘤的轉移及預后有關。由于CSC的耐藥性，傳統的腫瘤化療藥物不能有效殺滅CSC，最終導致腫瘤復發、轉移和治療失敗。因此，只有殺滅CSC，才能達到根治腫瘤的目的。

3 針對CSC的治療方案

根據CSC的特點，可以通過以下策略來發展以CSC為靶標的治療方案：①刺激靜止的CSC進入細胞周期，導致其分裂和分化，從而使其對化療或放療敏感。例如，細胞因子G?CSF能夠有效地誘導AML的“休眠”的白血病干細胞進入細胞周期，G?CSF與化療的結合治療能有效地誘導LSC的凋亡和去除［39］。②抑制CSC的DNA修復機制，結合放療或化療可使CSC的DNA損傷，易于凋亡。③針對CSC特異的自我更新機制，研發針對CSC特定信號通路的治療。這一策略的關鍵是找出特異性抑制CSC自我更新或生存的同時不危害正常組織干細胞和其它正常組織的試劑。事實上，某些已有的藥品可能正是在這個方面發揮了作用。例如維A酸通過抑制急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）干細胞自我更新并誘導其分化凋亡治療APL，而維A酸對正常造血干細胞幾乎沒有影響。④研發針對CSC特異的表面標記的單克隆抗體。例如針對AML干細胞的抗 CD44、IL?3R 抗體等［40－41］。

在新藥研發平臺中，使用小分子藥物、miRNA或siRNA文庫進行高通量篩選已成為熱點領域。應用針對乳腺癌干細胞的小分子藥物庫高通量篩選，找出了以前未被作為抗癌藥物的一類化合物——salino?mycin（鹽霉素），它能減緩乳腺癌的生長及肺轉移，可能直接作用于乳腺癌干細胞［42］。以microRNA為基礎的療法正在成為腫瘤治療的新型模式。值得一提的是，miR?34靜脈給藥能夠抑制小鼠前列腺癌的轉移并延長存活時間［43］。 這與 miR?34以 CD44（前列腺癌干細胞上高表達的表面標記）為靶標相關。

最后，必須再次提及non?CSC向CSC轉化的可能，因此對于大多數腫瘤而言，新型抗CSC的療法必須與傳統的針對non?CSC的治療（如化療）相結合，才是最終治愈腫瘤之道。

4 CSC研究的意義

隨著CSC在更多的不同腫瘤組織中分離成功，更有力地證明了CSC的存在，同時為深入探討腫瘤的發生、發展及評價預后等提供了新的理論依據，也為腫瘤的治療帶來了新的思路。

研究發現如果一個腫瘤的CSC比例越高，越容易出現轉移，預后越差，說明CSC與腫瘤的轉移及預后有關。由于CSC的耐藥性，傳統的腫瘤化療藥物不能有效殺滅CSC，最終導致腫瘤復發、轉移和治療失敗。因此，只有殺滅CSC，才能達到根治腫瘤的目的。