HPLC法測定痔瘡外洗顆粒中鹽酸小檗堿的含量

袁宏佳，郭洪明，梅 嬌，劉興文，姜 展

（重慶市北碚區中醫院，重慶 410007）

痔瘡外洗方為中華人民共和國衛生部部頒標準收載的散劑，是我院常用醫院制劑，由芒硝、黃連、魚腥草等組成，具有祛毒止癢、消腫止痛等功效，臨床用于治療痔瘡漏瘡、肛門痛癢療效顯著。方中黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用［1］。其主要有效成分為表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、小檗堿等生物堿。參考相關文獻［2-10］，選擇鹽酸小檗堿作為本試驗的指標成分，并采用高效液相色譜法測定其含量，為痔瘡外洗顆粒的質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

LC-20AT液相色譜儀（日本島津），SPD-20A紫外檢測器（日本島津），LC-solution色譜工作站，色譜柱：InertSustain C18，5μm，4.6mm×250mm（日本島津），十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒公司），SY1200T型超聲儀（上海聲源超聲波儀器設備有限公司），PTK-R1-10L型實驗室超純水機（帕泰克）。

鹽酸小檗堿對照品（中國藥品生物制品檢定所提供：批號713-9404），痔瘡外洗顆粒（由北碚區中醫院制劑室生產，批號：2017040-1，2017040-2，2017040-3），乙腈為色譜醇，水為超純水，其余化學試劑為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（30：70）；流速：1.0mL/min；檢測波長：345nm；進樣量：10μL；柱溫：30℃；理論塔板數按鹽酸小檗堿峰計算大于15000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿對照品約16mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得濃度為160μg/mL的對照品溶液。再精密吸取對照品溶液0.5、1、2、4、8mL，分別置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得鹽酸小檗堿對照品稀釋貯備液，并分別標記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。

2.3 供試品溶液的制備

稱取痔瘡外洗顆粒約2.5g，研細，精密稱定，置于具塞三角錐形瓶中，加入甲醇-鹽酸（100：1）的混合溶液50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液的制備

取方中藥材（除去黃連）按痔瘡外洗顆粒制備工藝同法制得缺黃連的陰性樣品。再稱取上述顆粒約2.5g，研細，精密稱定，按“2.3”項下方法制備陰性對照品溶液。

2.5 方法專屬性試驗

精密吸取鹽酸小檗堿對照品稀釋貯備液Ⅰ、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μl，分別注入色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定，得色譜圖，詳見圖1。

圖1（A為鹽酸小檗堿對照品溶液 B為痔瘡外洗顆粒樣品溶液 C為陰性對照溶液）

鹽酸小檗堿對照品保留時間在14分鐘左右，供試品溶液在相應位置也檢測到鹽酸小檗堿的峰，而陰性對照品溶液在此保留時間無干擾。表明處方中其他藥材不干擾鹽酸小檗堿的含量。

2.6 線性關系考察

精密吸取對照品稀釋貯備液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各10μl，進樣，按“2.1”項下色譜條件測定鹽酸小檗堿峰面積（A），并以其為縱坐標，同時以鹽酸小檗堿進樣濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A=39 129.4C+6 826.52，表明鹽酸小檗堿檢測濃度在8.447 5～135.16μg/ mL范圍內線性關系良好（r=0.999 9）。

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液，按含測依法操作后，立即進樣測定，并每隔一定時重復進樣測定一次，持續6h，經統計學處理，鹽酸小檗堿的峰面積積分值相對標準偏差RSD為1.37%，結果表明鹽酸小檗堿在6h內基本穩定。

2.8 精密度試驗

取供試品溶液，連續進樣5次，測定其峰面積積分值，結果統計：鹽酸小檗堿峰面積積分值的相對標準偏差RSD=0.07%。

2.9 重現性試驗

取同一批號的痔瘡外洗顆粒，依法重復操作測定5次，經統計學處理，測得鹽酸小檗堿的平均含量的相對標準偏差RSD=1.21%。

2.10 回收率試驗

采用加樣回收法，取已知含量的同一批號樣品，分別精密加入一定量的鹽酸小檗堿對照品，依法操作進樣測定，同法重復試驗6次，測得鹽酸小檗堿的平均回收率為100.04%，RSD=1.34%。

表1 加樣回收率試驗 （6次）

2.11 樣品含量測定

精密稱取不同批號的痔瘡外洗顆粒2.5g，按“2.3”項下方法制備供試液，按“2.1”項下色譜條件精密進樣10μl，測定。計算痔瘡外洗顆粒中鹽酸小檗堿含量，結果詳見表2。

表2 樣品的含量測定結果 （2次）

3 討 論

本品處方由7味中藥組成，而黃連為方中要藥，大量文獻報道鹽酸小檗堿為黃連中的主要活性成分，具有顯著的抗菌、消炎等作用。因此，選擇黃連中的鹽酸小檗堿作為含測指標成分，基本上能夠達到控制質量的目的。參考有關文獻含量測定方法［2-10］，并經多次實驗條件摸索，選擇了高效液相法測定本品中鹽酸小檗堿的含量，具有方法靈敏、簡便，分離度、重現性好的特點。

檢測波長的選擇。鹽酸小檗堿對照品溶液在200～600nm進行光譜掃描，結果在345nm波長處制劑中鹽酸小檗堿能有效分離，故選擇345nm為檢測波長。

參考相關文獻［2-10］，確定以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液為流動相，對流動相的不同比例進行考察，結果以乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液（30∶70）為最佳，基線平穩，鹽酸小檗堿分離最好，保留時間適中（約14分鐘）。

提取條件的選擇。本實驗采用水浴加熱回流提取、超聲提取、冷浸法分別對痔瘡外洗顆粒進行處理，考察不同提取方式對鹽酸小檗堿含量的影響。結果表明水浴加熱回流提取與超聲提取對于鹽酸小檗堿的溶出量差別不明顯，而冷浸法提取周期長，提取效率低，故從提取方法的簡便性，提取效率方面考慮，最終選擇超聲提取方法。并且分別考察了用100%甲醇、50%甲醇、甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液對痔瘡外洗顆粒進行處理，結果表明甲醇-鹽酸（100∶1）的混合溶液提取效果最佳。而對于提取時間就分別考察了15min、30min、45min、60min對鹽酸小檗堿含量的影響，結果表明隨著時間的延長，鹽酸小檗堿的含量無明顯變化，故選擇30min提取時間為宜。

HPLC法簡單、快速、重現性好，可用于制劑的質量控制。