七氟烷預處理上調miR-199a-5p對脊髓缺血/再灌注損傷的保護作用

鮑 寧，馬 虹

(1. 中國醫科大學附屬第一醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110001;2. 沈陽市婦嬰醫院麻醉科，遼寧 沈陽 110003)

脊髓缺血/再灌注損傷(spinal cord ischemia/reperfusion injury, SCIRI)是缺血脊髓組織恢復血液灌注后的二次損傷，是胸腹主動脈瘤手術患者的主要并發癥[1]。手術治療仍是治療的主要選擇，但效果欠佳。microRNA 在轉錄后水平調控基因表達，是目前研究基因治療和尋找藥物靶點的重要工具[2]，許多基因表達的改變已經在脊髓二次損傷中扮演重要的角色。七氟烷是廣泛應用于臨床的吸入麻醉藥，已有研究證明，七氟烷預處理通過調控microRNA保護心、肺等器官[3-4]。本課題組在前期大鼠SCIRI的微陣列芯片分析中發現，miR-199a-5p在大鼠SCIRI手術組比假手術組明顯降低，七氟烷預處理后miR-199a-5p明顯升高。本研究旨在探討miR-199a-5p在七氟醚預處理大鼠SCIRI中的作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級成年健康♂SD大鼠24只，體質量220～280 g，由中國醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證和使用許可證號分別為：SCXK(遼)013-0001、SYXK(遼) 013-0007。動物實驗部分已經通過中國醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2試劑 七氟烷(丸石制藥株式會社)；伊文思藍(美國Sigma公司)；反轉錄試劑盒(DBI公司)；TRIzol (TaKaRa公司)；RNasin(美國Promega公司產品)；TUNEL試劑盒(Roche公司)；抗caspase-9 、Bcl-2 、GAPDH抗體(Abcam公司)。

1.1.3儀器 R407小動物呼吸機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；BX-60熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Stratagene Mx3000P Real time PCR儀(美國Agilent公司)；DYY-7C電泳儀 (北京六一儀器廠)。高速離心機TGL-16G (上海安亭科學儀器廠)，水平電泳儀GDS7600(北京東方儀器廠產品)，凝膠掃描系統DF-23B(英國UVP公司)。

1.2動物模型的建立與分組大鼠隨機分為3組(n=8)：假手術組(Sham組)、模型組(I/R組)、七氟烷+模型組(SEVO+I/R組)。Sham組游離主動脈弓，不夾閉胸主動脈；I/R組單純建立大鼠缺血/再灌注損傷模型：將100 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(3.5 mL·kg-1)，氣管切開，氣管內插管連呼吸機。深層切口起胸廓頂端，并向左側第2肋骨胸骨結合部延伸，截斷左側第1、2肋骨，分離主動脈弓，將微血管夾放置在左頸總動脈和左鎖骨下動脈之間的主動脈弓上，阻斷時間為14 min，移除血管夾，逐層關閉胸腔和皮膚。遠端動脈壓持續下降至0.665 kPa以下，證明阻斷成功。模型制備過程中，以電加熱毯保溫，維持直腸溫度 36.5～37.5℃。SEV+I/R組的大鼠先放入自制密閉箱，規格為45 cm×32 cm×23 cm，保留自主呼吸，兩端各有1個進氣孔及出氣孔，底部鋪薄層鈉石灰，進氣端接麻醉機，設定七氟烷吸入濃度為40%，出氣端接麻醉氣體檢測儀，調整揮發罐和新鮮氣流量至出氣端七氟烷濃度為2.4%，吸入3 h七氟烷[5]。吸畢，行大鼠腹腔內麻醉，氣管切開處氣管內插管，連接呼吸機，隨后開胸手術，動脈夾夾閉主動脈弓14 min。各組于術后48 h進行Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分后，斷頭取髓(L4～6)。

1.3大鼠雙后肢運動功能評價采用Basso Beattie Bresnahan(BBB)評分標準，對各組大鼠在SCIRI 48 h時，進行后肢運動神經功能評分并記錄。

1.4TUNEL檢測脊髓組織細胞凋亡程度選擇厚度為4 μm的石蠟切片進行脫蠟，逐級乙醇水化，PBS漂洗，蛋白酶K儲存液覆蓋組織60 min，緩沖液洗3次，向組織樣品標本上滴加20 mg·L-1不含DNase的蛋白酶K，置于20～37℃環境下反應15～30 min。緩沖液洗3次，添加TUNEL反應混合液，置于濕盒內，37℃恒溫孵育2 h，PBS 漂洗3次后，加內源酶阻斷劑，PBS洗3次，切片甩干，加適量converter-POD，覆蓋組織，置于濕盒內，37℃孵育30 min，PBS洗3次。DAB顯色液顯色 10 min，流水沖洗后常規脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，細胞核呈現棕黃色或棕褐色為凋亡陽性細胞，統計并計算凋亡細胞率。光鏡下觀察凋亡細胞，每組于凋亡細胞分布區域隨機選24個高倍視野(×400)，每組8只大鼠各取1張切片，每張切片取3個視野，計算凋亡細胞數。

1.5EB測定血-脊髓屏障(blood-spinalcordbarrier,BSCB)完整性脊髓缺血/再灌注損傷48 h，大鼠尾部靜脈注射2% EB，1 h后處死大鼠，剖胸后，由右心室勻速注入生理鹽水沖洗血管內染料，取出L4～6脊髓，置于4%多聚甲醛，沉糖，在冰凍切片機上-20℃連續切片(10 μm) ，置于熒光顯微鏡紅色激光下觀察。依照熒光光斑的大小、疏密、強弱來評價脊髓組織中EB外滲量。

1.6Real-timeqPCR檢測脊髓缺血/再灌注損傷48 h后，各組取適量L4～6段脊髓組織，按照TRIzol 操作說明書，提取 RNA。以1 μg總RNA為模板，按照Bestar qPCR RT Kit 說明書配制逆轉錄反應體系，總體系為20 μL，合成cDNA第一鏈。按照DBI Bestar SYBRGreen qPCR masterMix 反應試劑盒的產品說明進行反應。熒光定量PCR儀進行熒光定量PCR實驗。miRNA 選用U6作為內參基因。所使用引物序列如下: miRNA-199a-5p 上游引物5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG GAACAGGTA-3′，下游引物 5′-ACACTCCAGCTGG GCCCAGTGTTCAGACTACC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.7Westernblot脊髓缺血/再灌注損傷后48 h，取L4～6段脊髓組織，迅速放入液氮后，-80℃冷凍保存。取40 mg脊髓組織剪碎后，加入0.5 mL 裂解液，勻漿，4℃、14 000 r·min-1離心15 min，取上清為總蛋白液。BCA法蛋白電量，SDS聚丙烯酰胺膠電泳，加入封閉液，室溫封閉2 h，加入一抗caspase-9(1 ∶4 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST漂洗3 次，每次10 min，加入HRP 標記的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌，化學發光，顯影，定影，采用 Image-Pro Plus 6.0凝膠圖像處理系統分析條帶光密度值。

2 結果

2.1大鼠神經運動功能變化如Fig 1所示，與Sham組比較，I/R組BBB評分明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，SEVO+I/R組 BBB 評分明顯增高(P<0.05)。

Fig 1 BBB score at 48 h after SCIRI n=8)

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group

2.2七氟烷預處理對細胞凋亡的影響Fig 2的TUNEL 染色結果顯示，脊髓缺血/再灌注后，神經元胞核較大，主要分布于前角和中間帶，部分細胞可見核固縮，深染，位于細胞的一側；七氟烷預處理組凋亡神經元數目明顯減少。用Sham組、I/R組、SEVO+I/R組凋亡細胞核占正常細胞核的百分比，評估脊髓細胞的凋亡率。結果顯示，與Sham組相比，I/R組的凋亡率明顯增加，而SEVO+I/R組凋亡率降低(P<0.05)，表明七氟烷預處理能減少因SCIRI引起的細胞凋亡。

2.3七氟烷對BSCB通透性的影響SCIRI后，BSCB破壞，EB外滲增加，通透性增加。造模后48 h，在熒光顯微鏡下，Sham組脊髓組織內幾乎均未見紅色熒光，I/R 組 48 h時脊髓組織中紅色熒光明顯增多；與I/R組相比，SEVO+I/R組紅色熒光明顯減弱(Fig 3)。

2.4七氟烷預處理對脊髓組織中miR-199a-5p表達的影響如Fig 4所示，與Sham組相比，I/R組miR-199a-5p表達明顯降低(P<0.05)；與 I/R組相比，SEVO+I/R 組 miR-199a-5p表達明顯增高(P<0.05)。

Fig 2 Apoptosis at 48 h after SCIRI groups by TUNEL

Fig 3 BSCB integrity at 48 h after SCIRI in three groups by EB extravasation fluorescence

Fig 4 miR-199-5p expression at 48 h after SCIRI n=8)

*P<0.05vssham group；#P<0.05vsI/R group

2.5七氟烷對脊髓組織caspase-9、Bcl-2表達的影響如Fig 5所示，與Sham組相比，I/R組caspase-9表達明顯增高，Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)；與 I/R組相比，SEVO+I/R組caspase-9表達明顯減少，Bcl-2表達明顯增加(P<0.05)。

Fig 5 Expression of caspase-9 and Bcl-2 at 48 h

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsS group

3 討論

microRNA(miRNA)是由18～24個核苷酸分子組成的短鏈非編碼RNA 分子，miRNA 是一類具有強大功能的代謝調節分子，可以特異性沉默mRNA，在轉錄后水平調控基因的表達[6]。miR-199a-5p在許多組織里都有表達，脊髓表達豐富[7]。目前研究表明，七氟烷通過調控miR-200c，保護肝缺血/再灌注損傷[8]，通過減少miR-15b表達，發揮抗凋亡作用，對腦缺血有保護作用[9]。在腦缺血/再灌注損傷模型中，七氟烷能夠減少神經細胞細胞凋亡，減輕腦水腫，縮小局灶性腦梗死體積，進而改善遠期神經功能[10]。在本實驗中，七氟烷對SCIRI有很好的保護作用，這與既往七氟烷對SCIRI研究結果一致。以往研究七氟烷保護SCIRI機制時，大多集中在氧化應激、炎癥反應、離子環境改變等，但這些都是研究信號通路的中下游途徑。本研究以miRNA為出發點，從分子生物學角度，對七氟烷預處理作用于大鼠SCIRI的保護機制進行研究，發現大鼠吸入2.4%七氟烷預處理3 h，能夠增加miR-199a-5p表達，減少脊髓組織細胞凋亡率，減少血-脊髓屏障通透性，對大鼠SCIRI發揮保護作用。說明七氟烷通過上調miR-199a-5p，保護SCIRI，與前期微陣列芯片分析結果一致。

一般認為BSCB破壞是SCIRI中最直接的病理改變[11]。正常情況下，EB不能通過BSCB，只有屏障結構破壞的情況下，才發生滲漏。本研究發現，脊髓缺血/再灌注損傷后，miR-199a-5p表達下調，BSCB破壞；七氟烷預處理后，miR-199a-5p表達上調，明顯降低了EB熒光外滲程度，說明BSCB破壞減輕，對脊髓有保護作用。血-脊屏障與血腦屏障相似，通過防止有害物質侵入，減少脊髓微環境波動，維持神經系統內環境相對穩定。七氟烷可以通過維持BSCB的完整性， 減輕大鼠SCIRI[12]。最近研究發現，在腸癌發展過程中，過度表達miR-199a-5p可以減少盤狀結構域受體1(discoidin domain receptor 1, DDR1)、基質金屬蛋白酶2(matrix matalloproteinases 2, MMP-2)的表達[13]。DDR1主要功能是調控膠原的合成及降解，與血腦屏障密切相關，而MMP-2增加血脊屏障通透性，DDR1、MMP-2的增加，破壞BBB和BSCB[14-15]，miR-199a-5p可以抑制DDR1、MMP-2的表達。我們推測，七氟烷預處理通過上調miR-199a-5p保護BBSB，減輕SCIRI，這與本實驗結果一致。本實驗結果顯示，缺血/再灌注前給予2.4%七氟烷預處理3 h，可以提高動物后肢運動功能的評分，同時提高了Bcl-2蛋白表達，降低caspase-9的表達，減少脊髓細胞凋亡，表明七氟烷預處理通過miR-199a-5p調控下游凋亡蛋白，保護SCIRI。

綜上所述，七氟烷通過上調miR-199a-5p，減輕血-脊屏障的破壞，減少細胞凋亡，保護脊髓缺血/再灌注損傷。但miR-199a-5p作用于哪個靶基因，通過哪條凋亡通路保護SCIRI，仍需我們進一步研究。

(致謝: 本實驗在中國醫科大學附屬第一醫院實驗中心、 麻醉科實驗室完成，在此對以上實驗室和實驗過程中給予指導和幫助的老師表示感謝! )