大豆皂苷對卵巢癌細胞耐藥性的影響

陸春曉，崔 越，何冬旭，馬 鑫

(江南大學1.藥學院和醫學院，2.國家重點工程實驗室，江蘇 無錫 214122)

越來越多研究表明，食用大豆能預防心血管類疾病以及癌癥的發生，這主要得益于大豆中的生物活性物質，如異黃酮、皂苷、植物甾醇等。其中，大豆皂苷具有防老化、抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用[1]。大豆皂苷屬于齊墩果烷三萜類化合物，是兩親性分子。目前，已研究確認了18種大豆皂苷，根據其化學結構可分為A類、B類、E類和DDMP類[2]。研究發現幾種常見的大豆皂苷：Bb、Bc、Ba、βg、βa、Ab、Ac，在大豆中含量較高[3]。近年來，研究者們也在不斷探索發現這些常見的大豆皂苷在多種疾病中的重要作用。大量研究表明，大豆皂苷在腫瘤發生、發展中具有重要作用，可抑制肺腺癌、淋巴癌、肥大細胞癌等細胞系Spc-A-1、YAC-1、P815的DNA合成，從而抑制腫瘤細胞的增殖，并且對人紅白血病細胞K562和結腸瘤細胞HCT-15具有殺傷作用[4]。

上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞向間質細胞轉化的現象，這種現象在胚胎形成與器官發育、組織修復與器官纖維化以及腫瘤的發生發展中均有發生[5]，涉及Wnt、TGF-β、Notch、PI3K/Akt等多種信號通路[6]。EMT現象與腫瘤細胞的轉移和耐藥性密切相關[7]。有研究表明，Raptor通過誘發EMT，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移[8]。Jenchlinger等[9]的研究發現，MAPK通路的激活在引發EMT現象的同時，也增加了多藥耐藥基因2的表達。本文主要研究了大豆皂苷減弱耐紫杉醇卵巢癌細胞A2780/PTX的EMT現象，降低細胞的遷移能力及其耐藥性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 大豆皂苷購自上海源葉生物科技有限公司；N-cadherin、E-cadherin抗體，購自Abcam公司；熒光二抗購自英濰捷基(上海)股份有限公司；DAPI染料購自上海碧云天股份有限公司；Cell Title-Blue@ Cell Viability Assay購自Promega公司。

1.1.2儀器 全功能微孔檢測儀(BioTek公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；正置顯微鏡、倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 耐紫杉醇卵巢癌細胞A2780/PTX由本實驗室構建。細胞在含體積分數為0.10胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養基，5% CO2、37℃飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2細胞活力檢測 A2780/PTX細胞分別用DMSO或100 mg·L-1大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac處理48 h。將處理過的細胞以7 000個/孔接種于96孔板中，培養24 h后，棄原培養基，加入不同濃度(0.01～500 mg·L-1)的紫杉醇處理48 h。每孔加入10 μl Cell Title-Blue溶液，繼續培養4～6 h后，使用全功能微孔檢測儀于激發光560 nm，發射光590 nm處檢測熒光值，用GraphPad Prism5軟件計算IC50值[10]。

1.2.3蛋白免疫印跡 提取A2780/PTX和加100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h后的耐藥細胞的蛋白，經SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜上，用0.05 kg·L-1BSA室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗滌4次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，每次10 min，ECL顯色液顯色，通過凝膠成像儀觀察大豆皂苷Ac處理后，細胞中N-cadherin、E-cadherin的表達變化。

1.2.4激光共聚焦檢測 A2780/PTX細胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h，分別接種適量未處理和處理后的A2780/PTX細胞于共聚焦小皿中，待細胞長到60%～70%融合時，加體積分數為0.04的多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌3遍，用體積分數為0.002的Triton X-100通透10 min；PBS洗滌3遍，0.05 kg·L-1BSA封閉30 min；一抗4℃孵育過夜；PBS洗滌3次，每次10 min，熒光二抗室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次10 min，DAPI孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min，使用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度。

1.2.5細胞遷移實驗 A2780/PTX細胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h。在24孔板中加入500 μL含體積分數為0.20胎牛血清的DMEM完全培養基，將Transwell小室(孔徑8 μm)置于24孔板中，接種5×104個DMEM基本培養基重懸的細胞于小室中，培養48 h。棄小室內的液體，將小室置于體積分數為0.04的多聚甲醛中固定30 min，PBS洗滌3遍；再用結晶紫染色15 min，PBS洗滌3遍。用棉簽擦去小室內的細胞，在顯微鏡下觀察遷移到小室底部的細胞數量。

1.2.6劃痕實驗 A2780/PTX細胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h，接種適量未處理和處理后的細胞于12孔板中，待細胞長至90%時，用槍頭垂直于孔板底部劃一條均勻筆直的劃痕，棄原培養基，用PBS洗滌3次，去除劃痕時掉落的細胞，加入無血清培養基培養。拍取0、24 h時的照片，觀察細胞的遷移情況。

2 結果

2.1不同大豆皂苷對A2780/PTX耐藥性的影響在A2780/PTX細胞中分別加入大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac處理后，與A2780/PTX細胞同時測量耐藥性。Tab 1結果顯示，加入不同大豆皂苷處理后，A2780/PTX的耐藥性均有減弱的現象，其中加入大豆皂苷Ac處理的效果最明顯，細胞的IC50值明顯降低。

**P<0.01vsA2780/PTX

2.2大豆皂苷Ac抑制EMTN-cadherin和E-cadherin是EMT的標志性蛋白，N-cadherin在耐藥細胞中高表達，而E-cadherin在耐藥細胞中低表達[11]。因此，本研究檢測大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細胞中N-cadherin和E-cadherin的表達情況。蛋白免疫印跡結果(Fig 1A)和激光共聚焦結果(Fig 1B)均顯示，經大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細胞中N-cadherin的表達降低(P<0.01)，E-cadherin的表達升高。證明大豆皂苷Ac能夠減弱腫瘤細胞的EMT現象，降低其耐藥性。

2.3大豆皂苷抑制腫瘤細胞的遷移能力細胞遷移實驗(Fig 2A)和劃痕實驗(Fig 2B)結果均顯示，大豆皂苷Ac處理后，遷移的細胞量減少。證明大豆皂苷Ac能減弱A2780/PTX細胞的遷移能力。

3 討論

大豆作為現今研究的一個熱點，已被證實在腫瘤及多種疾病中發揮重要作用，其活性物質大豆皂苷具有抗氧化、抗凋亡等多種作用[1]。研究表明，大豆皂苷(A1、A2、I)可通過抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介導的PI3K/Akt/NF-κB途徑的激活來鈍化炎癥[12]。也可以通過增強超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，減弱H2O2誘導的ROS，從而抑制腫瘤的發生、發展[13]。Avato等[14]的研究發現，特定結構類型的皂苷具有作為抗癌劑的潛在可能性，來自苜蓿屬物種的皂苷可以介導順鉑在腫瘤細胞中的作用。本文首先挑選了4種在大豆中含量較高的常見大豆皂苷，并從中篩選出了逆轉A2780/PTX細胞耐藥性效果最佳的大豆皂苷Ac。

Fig 1 Soyasaponin Ac affected expression of E-cadherin and N-cadherin of A2780/PTX cells

A2780/PTX cells were treated with 100 mg·L-1of soyasaponin Ac for 48 h, and the expressions of E-cadherin (E-cad) and N-cadherin (N-cad) were detected with Western blot (A) and laser scanning confocal microscopy (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

Fig2SoyasaponinAcaffectedmigrationability

A2780/PTX cells were treated with soyasaponin Ac (100 mg·L-1) for 48 h, cell migration was analyzed with transwell (A) and wound healing assay (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

EMT是上皮細胞呈現間充質特征的過程，在細胞纖維化和癌癥進展中起重要作用。 EMT的發生伴隨著E-cadherin、Laminin-1、Entactin、MUC-1等蛋白的下調，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin，以及轉錄因子Snail1、Twist、ZEB等的上調。研究報道，EMT在卵巢癌細胞的轉移中起重要作用，EMT由卵巢癌細胞系中的TGF-β、表皮生長因子、肝細胞生長因子和內皮素1誘導產生。同時，EMT與卵巢癌化療耐藥之間也存在密切關系。體外化學療法可誘導化療耐藥和EMT，并增加卵巢癌細胞的轉移能力，靶向抑制或逆轉EMT有望成為預防和治療卵巢癌的良好選擇[5,11]。為探索大豆皂苷Ac逆轉A2780/PTX耐藥性的作用機制，進一步檢測了大豆皂苷Ac處理后細胞的EMT現象。本實驗蛋白免疫印跡和激光共聚焦發現，大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細胞中N-cadherin表達降低，E-cadherin表達升高，EMT現象被抑制。同時，Transwell和劃痕實驗結果顯示，A2780/PTX細胞的遷移能力也隨之減弱，證實大豆皂苷Ac可以抑制A2780/PTX細胞的EMT現象和遷移能力，降低其耐藥性。腫瘤細胞的耐藥性已成為腫瘤臨床治療的一大難題，大豆皂苷Ac能逆轉A2780/PTX細胞的耐藥性這一發現，為卵巢癌的治療提供了新的思路和方向。