UPLC法測定大鼠血漿中海南粗榧內酯醇及其藥代動力學研究

方 偉，汪電雷，丁 艷，吳青青，吳 潔，姚兆敏

(安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230031)

海南粗榧內酯與海南粗榧內酯醇具有的碳骨架相同，如內酯環，但內酯醇在結構上多出2個氫原子[6]。其結構如Fig 1B所示，其分子式為C19H20O4，相對分子質量312.37。目前，國內外對該化合物的研究多集中于化學合成和藥理活性等方面[7]，作為具有相同碳骨架的生物堿，前期研究表明，海南粗榧內酯醇比海南粗榧內酯具有更強的藥理活性，但對其體內藥代動力學行為尚未見報道[8]。本文通過建立大鼠血漿中海南粗榧內酯醇的測定方法，考察其在大鼠體內的藥代動力學行為，旨在為其體內藥代動力學過程方面提供初步的參考依據，以期為構效關系以及新藥研發等方面提供有價值的依據。

Fig 1 Chemical structure of hainanolidel(A) and hainanolidol(B)

1 材料與方法

1.1藥品與試劑海南粗榧內酯(純度為99.0%)、海南粗榧內酯醇(純度為99.0%)，均由昆明植物研究所提供；水為超純水；甲醇(合肥科申化工有限公司)；乙腈(合肥科申化工有限公司)。

1.2實驗動物SPF級SD大鼠，♂♀各半，體質量(200±25) g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(皖)2017-001，實驗前禁食12 h，可自由飲水。

1.3儀器ACQUITY-CLASS UPLCTM(美國Waters公司)；Vortex-genie渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；Centrifuge臺式高速離心機(上海東兢電子有限公司)；BP212D型電子天平(德國Sartorius公司)。

1.4色譜條件菲羅門C18色譜柱100 mm × 2.10 mm，1.7 μm；流動相為甲醇-水(47 ∶53)；流速：0.17 mL·min-1；紫外檢測波長：326 nm；柱溫：25℃；靈敏度：0.001 AUFS；進樣量：3 μL。

1.5標準溶液配制精密稱取海南粗榧內酯醇1 mg，加10 mL甲醇配制成標準品溶液，使之濃度為100 mg·L-1，備用。內標溶液配制：甲醇溶解海南粗榧內酯2.50 mg，使其濃度為25 mg·L-1，備用。

1.6血漿處理取100 μL空白血漿，置于1.5 mL EP管中，精密吸取內標溶液海南粗榧內酯10 μL(25 mg·L-1)，渦旋30 s，再加入200 μL乙腈渦旋振蕩5 min沉淀蛋白，3 000 r·min-1離心10 min；精密吸取上清125 μL，再次12 000 r·min-1離心10 min，取上清于1.5 mL EP管中。

1.7動物實驗取上述SPF級SD大鼠18只，♂♀各半，隨機分為3組，按1、2、4 mg·kg-1的量經尾靜脈注射海南粗榧內酯醇(2 mL·kg-1)，在給藥前0 min和給藥后2、5、10、20、30、60、90、120、180、240、300、360 min等不同時間點眼眥取血0.3 mL，置于經肝素處理的EP管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離出血漿，按“1.6”項下血漿樣品處理操作，進樣分析。

1.8數據處理大鼠尾靜脈給藥后，測得各時間點的平均血藥濃度(c)-時間(t)數據，代入DAS2.1軟件分析，選擇合適的房室模型，進行藥動學參數的計算。

2 結果

2.2定量限的確定取0.1 mL空白血漿，加入0.05 mg·L-1海南粗榧內酯醇溶液，按“1.6”項下血漿樣品處理操作，按色譜峰信噪比S/N=10，得定量限為0.05 mg·L-1(準確度為96.65%，RSD=4.65%，n=5)，按色譜峰信噪比S/N=3作為檢測限，最低檢測限為0.01 mg·L-1。

2.3專屬性考察考察了海南粗榧內酯醇標準品血漿樣品(2.0 mg·L-1)加內標海南粗榧內酯(2.5 mg·L-1)、單劑量給藥4 mg·kg-1海南粗榧內酯醇30 min后大鼠血漿樣品、空白血漿樣品，每組6份。Fig 2為空白血漿、空白血漿中加入海南粗榧內酯醇及給藥后大鼠血漿樣品色譜圖，結果顯示，在按照“1.6”項下血漿樣品處理操作及“1.4”項建立的色譜條件下，海南粗榧內酯醇和海南粗榧內酯的保留時間分別為3.95 min、3.05 min左右。結果表明，在上述建立的色譜條件下，血漿中的內源性物質對海南粗榧內酯醇的測定無干擾。

2.4方法回收率考察分別取不同濃度的海南粗榧內酯醇溶液，加入0.1 mL的空白血漿，配制成0.1、1.0、8.0 mg·L-1的低、中、高3個濃度的質控血漿樣品，每個濃度平行5次，按“1.6”項下血漿樣品處理操作，進樣分析得到海南粗榧內酯醇峰面積As(H)。另取不同濃度的海南粗榧內酯醇標準溶液，用甲醇稀釋成低、中、高(0.1、1.0、8.0 mg·L-1)3個濃度的樣品，每個濃度平行5份，進樣分析得到海南粗榧內酯醇峰面積As(D)。回收率/%=As(H)/As(D)平均值×100%，計算海南粗榧內酯醇血漿樣品回收率。經計算，海南粗榧內酯醇低、中、高3個濃度樣品的回收率分別為(89.09±4.5)%、(86.33±4.7)%、(87.27±4.25)%，RSD分別為5.22%、5.61%、4.87%。符合生物樣品分析原則要求的回收率均大于85%。

Fig 2 UPLC chromatograms

A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with hainanolidol(2.0 mg·L-1) and hainanolide(2.5 mg·L-1); C: Plasma sample(30 min) after iv. administration of 4 mL·kg-1hainanolide spiked with hainanolide (2.5 mg·L-1). 1: hainanolide; 2: hainanolidol.

2.5精密度與準確度取低、中、高3個濃度的質控血漿樣品，各濃度平行5份，按“1.6”項下血漿樣品處理方法操作，測定日內精密度。低、中、高日內精密度分別為0.086%、0.937%、7.36%，日間精密度分別為0.092%、0.863%、7.32%。并通過線性回歸方程計算其濃度，與加入濃度進行比值計算，進而求得其準確度。結果見Tab 1，所有樣品準確度均在85%～115%范圍內，符合生物樣品分析原則要求。

Tab 1 Determination of accuracy and

2.6穩定性實驗按“1.6”項下血漿樣品處理操作，不同濃度的海南粗榧內酯醇溶液中加入0.1 mL的空白血漿，配制成低、中、高(0.1、1.0、8.0 mg·L-1)標準血漿質控樣品，各濃度平行5份，進行室溫長期放置，反復凍融3次和 -20℃冰箱凍存2周的實驗，并通過相應的計算來求算穩定性，結果見Tab 2。

Tab 2 The stability results of hainanolidol during sample storage, preparation and analysis in rat n=5)

2.7大鼠單劑量靜脈注射海南粗榧內酯醇的血藥濃度-時間曲線及主要藥代動力學參數大鼠單劑量注射海南粗榧內酯醇所得的平均血藥濃度-時間曲線見Fig 3。

Fig 3 Mean plasma concentration-time profiles of hainanolidol in rats after iv administration hainanolidol n=6)

將計算所得的血藥濃度-時間數據，采用DAS2.1軟件進行擬合(二室模型，權重系數為1)，進而求算藥代動力學參數。藥動學參數見Tab 3。低、中、高3個劑量的血藥濃度-時間曲線下面積AUC0-t與劑量相關性見Fig 4。

Tab 3 The main pharmacokinetic parameters of hainanolidol after iv administrations in n=6)

Fig 4 The does dependence with single does low, medium and high AUC0-t

3 討論

在色譜分離條件選擇上，因海南粗榧內酯醇文獻報道的相關研究較少，按一般有機溶劑和色譜柱的考慮因素，分別用甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，考察在不同溶劑中的溶解度，發現海南粗榧內酯醇和內酯醇在上述3種溶劑中均能完全溶解，從經濟成本上考慮，最終選擇甲醇作為溶劑相[13]。關于實驗內標的選取，考慮到海南粗榧內酯與內酯醇具有相同的碳骨架，是結構相似的同系化合物。紫外全波長掃描發現海南粗榧內酯醇的紫外最大吸收波長為326、360 nm，其中在326 nm波長左右海南粗榧內酯醇和海南粗榧內酯兩種化合物均有較強吸收，同時考慮到血漿中內源性雜質的紫外吸收等因素，綜合選擇326 nm為檢測波長。通過流動相的優化，最終選擇甲醇-水(47 ∶53)作為本實驗色譜檢測條件，在此條件下，海南粗榧內酯醇和海南粗榧內酯分別在3.95 min、3.05 min左右出峰，其分離度拖尾因子等方面均符合相關要求。

(致謝：本實驗在安徽中醫藥大學藥物代謝動力學實驗室設計并完成，衷心感謝本研究室全體成員對本實驗的大力幫助與支持。)