姜黃素納米粒對高脂誘導的心肌細胞損傷的作用

周 宇，李 晶，鮑翠玉

(湖北科技學院 1. 藥學院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發病率呈現逐年上升的趨勢[1]。糖尿病心肌病(diabetes cardiomyopathy，DCM)是一種相對于先天性心臟病、高血壓心臟病、冠狀動脈粥樣硬化、心臟瓣膜性病變和其他心臟病來說獨立發生的疾病，會改變心臟正常功能，導致心肌缺血和心力衰竭[2]。各種因素都有可能參與DCM的發生與發展，比如炎癥、氧化應激、線粒體損傷、心肌細胞中的糖脂代謝紊亂、心肌纖維化和心肌細胞凋亡都被認為是DCM的發病機制[3]。棕櫚酸(palmitic acid，PA)是血漿中含量最豐富的游離脂肪酸，持續高脂的刺激會造成心肌細胞的功能損傷，激活凋亡信號通路中的信號分子caspase、Bax、Bcl-2以及內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)信號通路，誘導細胞凋亡[4]。

姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，治療代謝相關性疾病，但由于姜黃素本身雙苯環結構所致，其水溶性很低，生物體內攝取率低，血液清除率高，進而生物利用率低下，限制了姜黃素在臨床治療中的應用。納米藥物遞送系統，尤其是納米高分子藥物遞送系統能明顯改善姜黃素水溶性差、生物利用率低等缺陷[5]，在姜黃素藥物制劑制備領域表現出良好前景。基于此，本研究建立高脂誘導的心肌細胞損傷模型，研究姜黃素納米粒(curcumin nanoparticles，Cur-NPs)對高脂誘導的心肌細胞損傷的保護作用及機制，為Cur-NPs在心血管疾病方面的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 H9c2心肌細胞購于上海通派生物有限公司。

1.1.2試劑 Cur-NPs由中國科學研究院長春應用化學研究所高分子物理與化學研究課題組提供。高糖DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、MTT(美國Gibco公司)；棕櫚酸(美國Sigma公司)；DAPI染液(武漢谷歌生物有限公司)；細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒、ECL試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；TUNEL試劑盒(美國Roche公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術公司)；抗Bcl-2、Bax、GRP78、CHOP抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州安泰公司)；CO2細胞培養箱(德國Heraeus公司)；HVE-50高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Bio-Tek公司)；自動發光凝膠成像系統(英國SYNGENE公司)；垂直式電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 H9c2心肌細胞培養在含10%胎牛血清和100 kU·L-1雙抗的高糖DMEM中，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育24 h，細胞充分貼壁生長融合至80%時，用含0.25% EDTA胰酶消化傳代培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2PA的配制 準備EP管裝有1 mL無水乙醇，用分析天平精準稱取PA粉末25.642 mg，把稱好的PA粉末倒入無水乙醇中，將EP管放入37℃水浴鍋中輕搖震蕩至完全溶解。然后使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，過濾后的儲存液濃度為100 mmol·L-1，使用前37℃水浴鍋將PA儲存液完全溶解至無沉淀物。給藥時，用含5% BSA的DMEM稀釋使用。

1.2.3Cur-NPs的配制 用分析天平精準稱取Cur-NPs粉末85 mg，溶于1 mL 1×PBS中，超聲至完全溶解，無需過濾。

1.2.4實驗分組 (1)PA濃度梯度：設為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1，進行MTT檢測；(2)PA時間梯度：設為12、24、48 h，進行MTT檢測；(3)PA濃度設為0.4 mmol·L-1，Cur-NPs濃度梯度設為0、20、40、80、160、200 μmol·L-1，進行MTT檢測；(4)Cur-NPs藥物療效檢測：設為正常對照組、PA 0.2 mmol·L-1、PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1、PA 0.4 mmol·L-1、PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1，進行ROS、TUNEL及免疫印跡檢測。

1.3檢測指標

1.3.1MTT法檢H9c2心肌細胞增殖率 在96孔板中接種H9c2心肌細胞懸液(每孔1×106細胞，每孔100 μL)，每組設置6個復孔。將96孔板放入細胞培養箱中培養24 h，待細胞完全貼壁，向每孔加入不同濃度含PA的培養基繼續培養相應時間。棄去孔內上清液，每孔加入20 μL的5 g·L-1MTT溶液，繼續培養4 h，用酶標儀讀取在570 nm處的吸光度值，按照以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率/%=實驗組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

1.3.2細胞ROS檢測 在24孔板中接種H9c2心肌細胞，向每孔分別加入不同濃度含PA的高糖DMEM培養基，繼續培養24 h，棄去孔內培養基，用不含胎牛血清的DMEM清洗2遍，按1 ∶500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制ROS試劑盒試劑，每孔加入500 μL配制好的試劑，細胞培養箱中培養20 min，棄去孔內培養基，用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室溫靜置10 min，1×PBS清洗2遍后收集細胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察，拍照。

1.3.3TUNEL檢測 在24孔板中接種H9c2心肌細胞，每孔分別加入不同濃度含PA的高糖DMEM培養基繼續培養24 h，棄去孔內培養基，1×PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定1 h，3%過氧化氫封閉10 min，0.1% Triton X-100滲透孵育2 min，1×PBS清洗2遍后，每孔加入50 μL TUNEL檢測試劑，放回細胞培養箱培養1 h。用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室溫靜置10 min，1×PBS清洗2遍后收集細胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察，拍照。

1.3.4蛋白免疫印跡法檢測 H9c2心肌細胞培養在37℃、5% CO2的細胞培養箱中孵育24 h，棄去培養皿中培養基，用1×PBS清洗2遍，加入裂解液，收集裂解液，離心取上清液， BCA法測定蛋白濃度。取合適量的總蛋白在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，轉膜后，在5%脫脂牛奶中封閉2 h。PVDF膜一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜后，二抗室溫孵育1 h。將PVDF膜與ECL顯影液充分接觸后，在化學發光凝膠成像系統中檢測凋亡信號通路蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2，以及ERS信號通路蛋白GRP78、CHOP蛋白表達情況。

1.4統計學方法數據均使用SPSS 17.0與GraphPad Prism7軟件分析處理，兩組數據間差異采用t檢驗進行計算。

2 結果

2.1高脂刺激對H9c2心肌細胞增殖率的影響Fig 1A結果顯示，不同濃度PA(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激H9c2心肌細胞24 h時，增殖率分別為101.4%、106.6%、102.2%、106.6%、71.7%和54.0%。與正常對照組相比，PA 0.4 mmol·L-1刺激心肌細胞24 h時，細胞增殖率開始出現明顯下降(P<0.01)。Fig 1B結果表明，0.4 mmol·L-1PA刺激H9c2心肌細胞0、12、24、48 h時，高脂所致的心肌細胞增殖率出現時間依賴性降低現象，PA 0.4 mmol·L-1刺激心肌細胞24 h時，細胞增殖率出現50%以上下降(P<0.01)。因此，在MTT實驗中，我們將PA濃度設為0.4 mmol·L-1，刺激時間設為24 h[6]。

2.2Cur-NPs改善高脂誘導的心肌細胞增殖能力低下如Fig 2A所示，小分子姜黃素不溶于水，溶 于DMSO，而納米化的姜黃素溶解于水溶液，提示Cur-NPs在溶解度方面優于小分子姜黃素，而溶解度的提高將有助于提高藥物的穩定性及生物利用度，大大改善其療效，降低毒性。Fig 2B結果表明，當0.4 mmol·L-1PA刺激24 h時，H9c2心肌細胞的增殖能力明顯降低，而不同濃度Cur-NPs預處理，可以不同程度改善高脂誘導的心肌細胞增殖能力的損傷，與PA組的29.4%比較，Cur-NPs(20、40、80、160、200 μmol·L-1)預處理組，細胞增殖率分別為45.9%、64.0%、70.8%、80.4%、84.4%。隨著Cur-NPs的濃度的升高，細胞增殖率呈現濃度依賴性升高趨勢，提示Cur-NPs對高脂誘導的心肌細胞增殖率的損傷有明顯的改善作用，在后續實驗中選擇Cur-NPs為200 μmol·L-1。

2.3Cur-NPs對高脂誘導的細胞氧化損傷的影響如Fig 3所示，與正常對照組比較，PA濃度為0.2 mmol·L-1時，細胞中ROS水平有所增加，細胞數目有所減少，另外，細胞出現輕微形態學改變，如細胞體積縮小、連接減少、細胞質密度增加、核質濃縮、核膜核仁破碎。當PA濃度為0.4 mmol·L-1時，細胞數量急劇減少，細胞質與細胞核均發生不同程度的改變，表現為細胞脹大、胞膜破裂、細胞內容物外溢等現象。Cur-NPs對高脂誘導的心肌細胞氧化損傷有明顯改善作用，PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.2 mmol·L-1相比，細胞形態更加完整，細胞膜破裂情況消失。PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組相比，細胞數目接近于正常對照組，細胞質與細胞核的形態也接近于正常對照組。

Fig 1 Effect of high fat on proliferation of H9c2

**P<0.01vscontrol group

Fig 2 Solubility and anti-cell damage efficacy of curcumin nanoparticles

2.4Cur-NPs對高脂誘導的細胞凋亡的影響Fig 4A結果表明，與正常對照組比較，PA濃度為0.2 mmol·L-1時，細胞數目有所減少，細胞質與細胞核均發生輕微形態學改變。PA 0.4 mmol·L-1與正常對照組相比，TUNEL標記的紅色熒光明顯增強，但細胞數目出現明顯減少，細胞質與細胞核均發生明顯的細胞凋亡相關形態學改變，如核固縮、核碎裂、胞膜破裂、細胞內容物外溢等。Cur-NPs對高脂誘導的心肌細胞凋亡有明顯改善作用， PA+Cur-NPs組與PA組相比，TUNEL標記的紅色熒光明顯降低，細胞數目與細胞形態基本恢復正常，接近于正常對照組。

如Fig 4B所示，PA 0.2 mmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組caspase-3蛋白的表達水平與正常對照組相比明顯增高(P<0.01)，當PA濃度為0.2 mmol·L-1時，Bax/Bcl-2比值與正常對照組相比明顯增高(P<0.05)；PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組caspase-3蛋白的表達水平相對于PA0.2 mmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.01)，PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組Bax/Bcl-2比值相對于PA 0.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Effect of Cur-NPs on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage(×20)

1：Control; 2：PA 0.2 mmol·L-1; 3：PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1; 4：PA 0.4 mmol·L-1; 5：PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1.

Fig 4 Effect of Cur-NPs on apoptosis of cardiomyocytes induced by PA

2.5Cur-NPs對高脂誘導的心肌細胞ERS信號通路激活的影響如Fig 5所示，PA 0.4 mmol·L-1組GRP78和CHOP蛋白的表達水平與正常對照組相比明顯增高(P<0.05)，PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組GRP78和CHOP蛋白的表達水平相對于PA 0.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)。

Fig 5 Effect of Cur-NPs on expression of GRP78 and CHOP protein in cardiomyocytes induced by high n=3)

1：Control; 2：PA 0.2 mmol·L-1; 3：PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1; 4：PA 0.4 mmol·L-1; 5：PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA.

3 討論

糖尿病會導致一系列器官或者系統的病理性改變，包括血管、心臟、腎臟、眼睛、足部、神經等部位的并發癥[7]。DCM病理表現為心肌的代謝紊亂、微小血管病變導致的心肌肥大、細胞的壞死與凋亡和間質纖維化[8]。DCM會改變心臟正常功能，導致心肌缺血和心力衰竭。持續高脂的刺激會造成心肌細胞的功能損傷，引起心肌細胞的氧化應激和凋亡。PA被廣泛用于細胞或動物實驗中脂毒性損傷模型的建立，在體外實驗中發現，PA能誘導心肌細胞、肝細胞、胰島細胞、視網膜神經節細胞、腎小球足細胞等出現損傷[9]。本研究中，我們采取不同刺激濃度、不同刺激時間來檢測PA對H9c2心肌細胞增殖能力的影響，發現PA濃度為0.4 mmol·L-1，刺激時間為24 h時細胞增殖率開始出現明顯下降。

姜黃素通過多種途徑保護細胞，能夠減輕細胞的凋亡[10]。但由于姜黃素水溶性低、生物利用度低、血液清除快，使姜黃素在臨床治療中的應用受到了限制。納米藥物遞送系統能明顯改善這些缺陷，本研究檢測了Cur-NPs對高脂誘導的心肌細胞損傷的保護作用。MTT結果顯示，PA 0.4 mmol·L-1刺激細胞24 h后，細胞增殖率明顯下降，給予不同濃度的Cur-NPs預處理后，細胞的增殖水平逐漸恢復。根據MTT實驗結果，我們選擇200 μmol·L-1為后續實驗的Cur-NPs給藥濃度。

高脂環境持續刺激機體時，機體ROS產生越來越多，且不能及時有效地清除，會使細胞氧化與抗氧化功能打破正常工作狀態，產生氧化應激損傷。本研究中，當PA濃度為0.2 mmol·L-1時，與正常對照組相比，細胞ROS明顯增加，而且細胞開始出現凋亡相關形態學改變，當PA濃度為0.4 mmol·L-1時，細胞數量急劇減少，細胞發生明顯的凋亡。說明長時間暴露于高脂環境下，可使心肌細胞發生氧化應激損傷，導致細胞的形態和數目發生改變，最終導致心肌細胞出現凋亡，影響心臟的正常功能。同時，我們通過TUNEL檢測試劑盒發現，隨著PA濃度的增加，H9c2心肌細胞逐漸出現凋亡相關改變。當PA濃度增加為0.4 mmol·L-1時， TUNEL標記的紅色熒光明顯增強，同時細胞數量明顯減少，細胞失去正常形態，呈現明顯的凋亡相關形態學變化。給予Cur-NPs預處理后，細胞的氧化損傷和凋亡均出現明顯改善，細胞的數目和形態也逐漸恢復正常。

目前凋亡通路研究較多，細胞內氧化應激[11]、DNA損傷、鈣離子超負荷等都可以引起細胞色素C和細胞凋亡蛋白酶激活因子1形成了凋亡復合體，使caspase-3和caspase-9的激活，引起caspase級聯反應[12]。大量結果表明，Bax和Bcl-2在凋亡通路中有重要作用[13]。本研究證實，H9c2心肌細胞給予0.4 mmol·L-1PA刺激24 h時，細胞內caspase-3的水平明顯增高，給予0.2 mmol·L-1PA刺激時，Bax/Bcl-2比值明顯增高；Cur-NPs預處理后，與PA組相比，PA+Cur-NPs組的caspase-3表達水平及Bax/Bcl-2比值明顯降低，證實Cur-NPs可以明顯降低由高脂誘導的心肌細胞的凋亡水平。進一步觀察了ERS相關蛋白GRP78和CHOP的表達，發現高脂環境下心肌細胞中ERS相關蛋白表達明顯升高，Cur-NPs預處理可以明顯降低由高脂引起的ERS蛋白的表達升高。

綜上所述，心肌細胞給予高脂刺激能夠抑制細胞的增殖，并且會導致細胞內ROS的增加，激活心肌細胞內ERS通路，從而促進細胞凋亡。Cur-NPs可以有效恢復細胞增殖率，降低氧化損傷，抑制ERS通路的激活，最終減少細胞凋亡，起到保護心肌細胞的作用。說明Cur-NPs能成功逆轉高脂誘導的心肌細胞損傷，其作用機制與ERS通路密切相關。