鈉-鈣交換體單克隆抗體NCX-2D2對異丙腎上腺素誘發成年大鼠心律失常的抑制作用

薛曉艷，王苗苗，王曉露，楊明珠，吳博威，封啟龍

(1. 山西醫科大學生理學系，細胞生理學省部共建教育部重點實驗室，山西 太原 030001；2. 山西醫科大學晉祠學院機能教研室，山西 太原 030025；3. 中山大學中山醫學院，廣東 廣州 510080)

近年來，隨著社會經濟發展和國民生活方式的改變，我國心血管疾病的發病率及病死率逐年上升[1]。心律失常是其中較常見的臨床表現，尤其是諸多惡性心律失常如室性心動過速、心室顫動，可對患者造成致命的影響。目前，抗心律失常藥物的效果并不理想，有效率約為30%～60%[2]，并且往往具有誘發新的心律失常或使原有心律失常加重的風險。因此，探究心律失常發生的機制，研發新的抗心律失常藥物仍是目前研究的熱點問題之一。

據文獻報道，心律失常的發生與細胞內鈣穩態關系密切相關[3]。心肌細胞內鈣離子穩態的維持有賴于多種鈣調控蛋白，其中一種重要的鈣調控蛋白為細胞膜上的鈉-鈣交換體(sodium-calcium exchanger，NCX)[4]。它在多種細胞廣泛存在，在心肌細胞表達尤為豐富，對心肌細胞的鈣轉運起著關鍵作用。NCX是一種雙向離子轉運體，有兩種工作模式：前向模式(forward mode)將3個鈉離子轉入細胞內，1個鈣離子轉出細胞；反向模式(reverse mode)將1個鈣離子轉入細胞內，3個鈉離子轉出細胞。因此，NCX具有生電性，其產生的電流稱為鈉-鈣交換電流(INa/Ca)。在病理情況下，NCX是導致細胞內鈣超載機制的主要原因。例如，在心肌缺血/再灌注損傷和心力衰竭的情況下，細胞內Na+水平的增加將促使反向模式NCX活動增強，從而促進鈣超載引起心臟功能障礙[5-6]。此外，伴隨著舒張期NCX鈣外排產生的內向跨膜離子流也會增大，形成短暫的基礎內向離子流，這種內向電流是心肌病理狀態下發生延遲后除極(delayed after depolarization，DADs)及心律失常的重要原因[7-8]。

大量研究表明，α肽段的重復序列α-1和α-2是NCX發揮作用的關鍵區域[9-10]，因此，其所對應的抗體有可能對NCX起調控起作用。本實驗室前期研究已經證實，鈉-鈣交換體α-2(840-877)3F10單克隆抗體對單個大鼠心室肌細胞INa/Ca有一定的抑制作用，對INa、IK1、Ito等均未見明顯作用。此外，該抗體還可以抑制缺血/再灌注誘發的心律失常[11]。本實驗經異丙腎上腺素(isoproterenol，ISO)建立大鼠在體和離體心律失常模型，研究NCX單克隆抗體α-2(840-877)2D2的抗心律失常作用，并通過全細胞膜片鉗技術探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康成年SPF級SD大鼠，♂，體質量(235±15)g，購自山西醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK-(晉)2015-0001。動物飼養條件為室溫(23～25) ℃、自由飲水、進食。

1.2藥物與試劑膠原酶P購自瑞士Roche公司；ISO購自英國Tocris公司；牛磺酸、HEPES、L-谷氨酸、氫氧化銫(CsOH)等購自美國Sigma公司；其余試劑均為國產分析純產品。分泌單克隆NCX-2D2抗體的雜交瘤細胞株是利用NCX α-2第840-877位氨基酸殘基肽段免疫小鼠脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合制成，并由美國Invitrogen公司制備；NCX-2D2抗體的純化由北京華大蛋白質研發中心有限公司制備。

1.3儀器Axopatch200B膜片鉗放大器(美國Axon Instruments公司)；BL-420F生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；Langendorff心臟灌流系統(澳大利亞AD Instruments公司)；Digidate1440A數模轉換器(美國Axon Instruments公司)；電動式微操縱器(Sutter Instruments公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；微電極拉制儀(Narishige公司)。

1.4溶液配制

1.4.1臺氏液(mmol·L-1) HEPES 5.0、MgCl21.0、KCl 5.4、葡萄糖10.0、NaH2PO40.33、NaCl 140、CaCl21.8配制，經NaOH調節pH至7.38～7.40。

1.4.2KB 液(mmol·L-1) MgSO43.0、?；撬?20.0、EGTA 1.0、KH2PO425.0、L-谷氨酸50.0、HEPES 10.0、KCl 40.0、葡萄糖10.0，使用KOH調節pH至7.38～7.40。

1.4.3酶液 在無鈣臺氏液中加入膠原酶P 0.07～0.10 g·L-1、牛磺酸 20.0 mmol·L-1，經NaOH調節pH至7.36～7.40。

1.4.4Na+/Ca2+交換電流電極內液與L-型鈣電流電極內液(mmol·L-1) 配制見參考文獻[11]。

1.4.5動作電位內液與動作電位外液 動作電位內液(mmol·L-1)：磷酸肌酸二鈉鹽 5.0、KCl 140.0、HEPES 10.0、Mg-ATP 5.0、MgCl22.0配制，并經KOH調節pH至7.20。動作電位外液(mmol·L-1)： KCl 5.4、葡萄糖 10.0、CaCl22.5、HEPES 10.0、NaCl 134.0、MgCl21.0配制，并經 NaOH調節pH至7.38～7.40。

當運動產生的加速度影響較大時,需要加速度分離算法分離出重力加速度分量與陀螺儀參數進行融合進行校準。由探測器的飛行規律可知,運動加速度主要作用于載體的前進方向X,導致加速度計傳感器的z軸方向測量數據出現偏差,而加速度計的x軸和y軸和運動方向垂直,測量值為重力加速度的分量且不受運動影響。如式(8)所示,利用x軸和y軸的加速度計測量數據可以對z軸的重力加速度分量進行估計,獲得重力加速度三軸分量,并可進一步獲得運動加速度。式中aX的方向可以結合當前姿態角獲得。

1.5NCX-2D2抗體的制備運用化學合成的NCX-2D2第(840-877)肽段作為抗原對小鼠進行免疫，經過ProteinA親和柱可得到純化的免疫血清，應用SDS-PAGE法和ELISA法，對所得抗體進行純度和滴度檢測，可得到純度較高的2D2抗體。

1.6離體心律失常模型的建立大鼠經40 mg·kg-1戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉，開胸心臟離體后，懸掛于Langendorff 裝置，用高鈣臺氏液行主動脈逆行灌流，流速為8 mL·min-1，同步記錄心電圖，待心臟活動穩定后，藥泵給藥。實驗分組: ① 對照組：含2.5 mmol·L-1CaCl2的臺氏液灌流；② 2D2 抗體+CaCl2組：含10 mg·L-1NCX-2D2抗體、2.5 mmol·L-1CaCl2的臺氏液灌流；③ ISO+CaCl2組：含1 μmol·L-1ISO、2.5 mmol·L-1CaCl2的臺氏液灌流；④ 2D2抗體+ISO+CaCl2組：含10 mg·L-1NCX-2D2抗體、1 μmol·L-1ISO、2.5 mmol·L-1CaCl2的臺氏液灌流。觀測各組離體大鼠心臟心電圖改變，記錄給予藥物后30 min內室性早搏發生的個數，室性心動過速的發生率和持續時間，心室顫動的發生率和持續時間。

1.7在體心律失常模型的建立成年健康SD大鼠稱重，10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術臺，連接BL-420F生物機能實驗系統，記錄Ⅱ導聯心電圖，監測穩定后，通過尾靜脈給藥。實驗分組如下：① 對照組：1 mL生理鹽水(NS)尾靜脈注射；② 2D2抗體組：80 μg·kg-1NCX-2D2抗體溶于1 mL NS中尾靜脈注射；③ ISO組：1.28 mg·kg-1ISO溶于1 mL NS中尾靜脈注射；④ 2D2抗體+ISO組：80 μg·kg-1NCX-2D2抗體溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射，5 min后1.28 mg·kg-1ISO溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射；⑤ 胺碘酮+ISO組：5 mg·kg-1胺碘酮溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射，5 min后1.28 mg·kg-1ISO溶于0.5 mL NS中尾靜脈注射。觀測各組大鼠體表心電圖，記錄經藥物干預后1 h內室性早搏發生的個數，室性心動過速的發生率和持續時間，心室顫動的發生率和持續時間。

1.8全細胞膜片鉗記錄

1.8.1單個大鼠心室肌細胞的分離 健康SD大鼠，用戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，開胸取出心臟，置于預先經純氧充灌的4℃無鈣臺氏液中，剪去多余組織，主動脈逆行插管懸于Langendorff灌流裝置。以無鈣臺氏液灌流心臟8～10 min后，用酶液循環灌流15～20 min，待心臟酶解后，在KB液中將左心室肌組織剪碎，用吸管吹打3～5 min后，經濾網過濾(150 μm孔徑)取得單個心室肌細胞，并于KB液中保存，穩定后進行實驗。

1.8.2全細胞膜片鉗的記錄 吸管吸取細胞懸液1～2滴，滴于倒置顯微鏡的細胞槽(約1 mL)內，貼壁 8～10 min，再用含鈣臺氏液復鈣灌流(流速2 mL·min-1)。電極拉制儀拉制玻璃電極，充灌電極內液，電阻為3～5 MΩ。鏡下挑選紋理清晰、無自主收縮的長桿狀細胞為實驗對象，用玻璃電極給予負壓封接，并迅速回抽給予負壓破膜，用膜電容補償和串聯電阻補償后，進行全細胞記錄。數據采集，保存及分析備用。

1.8.3單個心室肌細胞Na+/Ca2+交換電流的記錄 在電壓鉗模式下，鉗制電位于-40 mV，通過+60 mV ～ -120 mV的斜坡電壓刺激(90 mV·s-1)，5.0 mmol·L-1的NiCl2特異性阻斷Na+/Ca2+交換電流，阻斷前后的電流差為Ni2+敏感的Na+/Ca2+交換電流。

1.8.4單個心室肌細胞L-型鈣電流的記錄 L-型鈣電流(ICa-L)的記錄參照參考文獻[11]。膜電流的大小用電流密度表示(單細胞電流值/細胞膜電容值，pA/pF)。

1.8.5單個心室肌動作電位(AP)及DADs 在電流鉗模式下，用動作電位外液進行灌流，并記錄動作電位。給予細胞15 ms、3 Hz連續5次刺激誘發動作電位，之后給予藥物誘發DADs。

2 結果

2.1單克隆抗體NCX-2D2對ISO誘發大鼠離體心臟心律失常的作用結果表明，10 mg·L-1NCX-2D2抗體可明顯抑制ISO誘發大鼠離體心臟心律失常的出現。給予ISO后，30 min內大鼠室性心動過速的發生率為100%，持續時間為(187.81±23.14)s；心室顫動的發生率為57.14%，持續時間為(9.29±8.94)s；室性早搏個數為(328±22)(P<0.01)。在給予10 mg·L-1NCX-2D2抗體和ISO灌流后30 min內，大鼠室性早搏個數降低至(104±9)；室性心動過速持續時間縮短至(11.29±15.84)s，室性心動過速發生率降低至42.8%；心室顫動完全消失(P<0.01)。見Tab 1、Fig 1。

2.2NCX-2D2對ISO誘發麻醉大鼠心律失常的作用結果表明，NCX-2D2抗體可明顯抑制ISO誘發麻醉大鼠心律失常的發生。給予ISO后1 h內，大鼠室性心動過速的發生率為100%，持續時間(40.73±3.06)min；心室顫動發生率為57.14%，持續時間(4.57±4.46)min；室性早搏個數為(774±31)。在給予ISO前5 min，預先給予80 μg·kg-1NCX-2D2抗體干預后1 h內，大鼠心室顫動完全消失,室性心動過速發生率降低至42.8%，持續時間縮短至(0.90±1.13)min；室性早搏個數減少至(168±33)。80 μg·kg-1NCX-2D2抗體抑制由ISO誘發麻醉大鼠室性心律失常的作用與胺碘酮相似，甚至在抑制早搏方面略優于胺碘酮(P<0.01)。見Tab 2、Fig 2。

Fig 1 Effect of NCX-2D2 antibody on ISO -induced arrhythmiasin vitro rat hearts by representative electrocardiogramtraces(recorded fromⅡlimb leads)

A: Trace from Tyrode group; B: Trace from NCX-2D2 antibody (10 mg·L-1) treated group; C: Trace from ISO (1 μmol·L-1) treated group; D: Trace from ISO (1 μmol·L-1) and NCX-2D2 antibody (10 mg·L-1) treated group; E: Examples of arrhythmias recorded from rats in the present study. a: Normal ECG; b: Premature ventricular contraction bigeminies; c: Premature ventricular contraction trigeminies; d: Ventricular tachycardia; e: Ventricular fibrillation.

Tab 1 Effects of NCX-2D2 antibody on arrhythmia induced by ISO in vitro adult rat hearts(n=7)

PVB: Premature ventricular beats; VT: Ventricular tachycardia; VF: Ventricular fibrillation; 2D2: NCX-2D2 antibody.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsISO.

Tab 2 Effects of NCX-2D2 antibody on arrhythmia induced by ISO in anesthetized rats in vivo(n=7)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsISO;△△P<0.01vsamiodarone

Fig 2 Effect of NCX-2D2 antibody on ISO-inducedarrhythmias in vivo rat hearts by representativeelectrocardiogram traces (recorded fromⅡlimb leads)

A:Trace from NS group; B: Trace from NCX-2D2 antibody (80 μg·kg-1) treated group; C: Trace from ISO (1.28 mg·kg-1) treated group; D: Trace from ISO (1.28 mg·kg-1) and NCX-2D2 antibody (80 μg·kg-1) treated group; E: Trace from Amiodaron (5 mg·kg-1) and ISO treated group; F: Examples of arrhythmias recorded from rats in the present study. a: Normal ECG; b: Premature ventricular contraction bigeminies; c: Ventricular tachycardia; d: Ventricular fibrillation.

2.3NCX-2D2可部分逆轉ISO對單個大鼠心室肌細胞INa/Ca的增大作用在電壓鉗模式下，鉗制電位-40 mV，給予+60 mV ～ -120 mV的斜坡電壓刺激(90 mV·s-1)，經5.0 mmol·L-1的NiCl2特異性地阻斷INa/Ca，阻斷前后的電流差即為Ni2+敏感的Na+-Ca2+交換電流(Fig 3)。

鉗制電位于+50 mV和-100 mV時，與對照組相比，ISO組心室肌細胞INa/Ca明顯增大(P<0.01)。ISO未洗脫給予5 mg·L-1NCX-2D2抗體后，INa/Ca的外向和內向電流與ISO組相比明顯降低，但并沒有恢復至正常水平。此抗體對INa/Ca外向(+50 mV)和內向(-100 mV)電流的抑制率分別為28%和20%(P<0.01)。見Tab 3、Fig 4。

Fig 3 Measurement of Ni2+sensitive Na+-Ca2+exchange current (INa/Ca) in rat ventricular myocytes

A:Current-voltage relationship before (a) and after (b) application of 5.0 mmol·L-1NiCl2; B: Ni2+-sensitiveINa/Ca(numerical subtraction of a-b).

2.4NCX-2D2可部分抑制ISO對單個大鼠心室肌細胞ICa-L的增大作用Fig 5結果顯示，與對照組相比，ISO組心肌細胞ICa-L明顯增大(P<0.01)。應 用5 mg·L-1NCX-2D2抗體后，與ISO組相比，ICa-L明顯降低，但并沒有恢復至正常水平(P<0.01)，此抗體對ICa-L的抑制率為19%。

Tab 3 Effects of NCX- 2D2 antibody and ISO on INa/Cain isolated rat ventricular myocytes(n=7)

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsISO

Fig 4 Inhibitory effect of NCX- 2D2 antibody on ISO-induced increase INa/Ca in normal rat ventricular myocytes

A: Current-voltage relationship. a: ISO(1 μmol·L-1); b: ISO(1 μmol·L-1) +2D2(5 mg·L-1); c: Control; d: Application of 5.0 mmol·L-1NiCl2; B: Current-voltage relationship. Ni2+-sensitiveINa/Caof ISO: (a-d); Ni2+-sensitiveINa/Caof ISO+2D2: (b-d); Ni2+-sensitiveINa/Caof control:(c-d).

2.5NCX-2D2對ISO誘發單個大鼠心室肌細胞動作電位DADs的抑制作用在電流鉗模式下，記錄動作電位DADs。DADs的產生可通過連續刺激(頻率15 ms、3 Hz)誘發。Fig 6結果表明，對照組與NCX-2D2抗體組都沒有出現DADs；給予ISO(1 μmol·L-1)后，單個大鼠心室肌細胞DADs發生率為85.71%；而給予5 mg·L-1NCX-2D2抗體干預后，可有效抑制ISO誘發的單個大鼠心室肌細胞DADs的發生，其發生率降低至14.29%，與ISO組相比明顯降低(P<0.05)。

Fig 5 Inhibitory effect of NCX- 2D2 antibody on ISO-induced increase ICa-L in normal rat ventricular myocytes

Fig6InhibitoryeffectofNCX-2D2antibodyonISO-inducedDADsinnormalratventricularmyocytes

a: Control; b: 5 mg·L-1NCX-2D2; c: 1 μmol·L-1ISO; d: 5 mg·L-1NCX-2D2+1 μmol·L-1ISO.

3 討論

最新研究提出，NCX新的結構模型為10次跨膜[12]，α-2序列可能位于細胞外側，這解釋了2D2抗體從胞外側發揮作用的機制，這與傳統的9次跨膜的二級結構模型不同，不同之處主要在于第7跨膜段之后肽鏈的空間排列。本研究選取NCX α-2(840～877)肽段作為抗原，制備獲得NCX-2D2單克隆抗體，并且觀察了該抗體對ISO誘發成年大鼠心律失常的影響。結果表明，鈉-鈣交換體單克隆抗體NCX-2D2對ISO誘發的大鼠離體和在體心律失常均有明顯抑制作用。利用全細胞膜片鉗技術研究發現，該抗體可部分逆轉ISO對INa/Ca及ICa-L的增大作用，對ISO誘發的DADs也有明顯的抑制作用。因此推斷，其抗室性心律失常的機制主要與抑制心肌細胞鈉-鈣交換體和L-型鈣通道，減輕胞內鈣超載、抑制DADs有關。大量文獻報道，DADs在多種心律失常的發生中具有重要作用[13]，其發生主要與胞內鈣超載和INa/Ca增強有關。本研究中，ISO可激活β受體，使細胞膜腺苷酸環化酶的活性增加，提高細胞內cAMP的濃度，通過cAMP蛋白激酶系統，增大鈣內流，從而加重細胞內鈣超載，而胞內鈣超載又會導致鈉-鈣交換活動增強，通過產生一過性的內向電流，參與誘發DADs[14]。

本研究選用ISO建立大鼠心律失常模型。 ISO屬于兒茶酚胺類藥物，主要作用于β受體，使心肌收縮力增強，心率加快，傳導加速。但臨床使用不當也有致心律失常的副作用，尤以室性心動過速及心室顫動等惡性心律失常較為多見[15]。本實驗在制備獲得鈉-鈣交換體2D2抗體的基礎上，為了達到抗心律失常的目的，擬通過抑制鈉-鈣交換體和L-型鈣通道的異?；顒?，使心肌細胞內的鈣超載減輕。實驗結果顯示，鈉-鈣交換體NCX-2D2抗體可有效抑制ISO對大鼠心室肌細胞INa/Ca及ICa-L的增大作用，同時還可明顯抑制ISO誘發心肌細胞DADs的發生，闡明了NCX-2D2抗體抗心律失常的主要電生理機制。

綜上，本研究證實鈉-鈣交換體單克隆抗體NCX-2D2可明顯抑制由ISO誘發的大鼠室性心律失常，其抗室性心律失常的機制與抑制鈉-鈣交換體和L-型鈣通道，減輕鈣超載、抑制DADs有關。本研究結果為臨床預防和治療兒茶酚胺類藥物相關性心律失常的發生提供了一定的理論依據和實驗證據。

(致謝：本研究在山西醫科大學生理學系細胞生理學省部共建教育部重點實驗室完成，感謝吳博威教授和趙錄英老師給予的技術指導。)