五味消毒飲中大孔樹脂分離部位的體外抗菌活性研究

張曉青 惠華英 李斌 陳伶利

〔摘要〕 目的 檢測五味消毒飲不同分離部位的體外抗菌活性，為五味消毒飲的二次開發提供實驗依據。方法 本研究將五味消毒飲水煎液用NKA-9大孔樹脂進行吸附分離得到不同部位的洗脫液，用牛津杯法測定其抑菌圈，并用試管稀釋法檢測洗脫液對細菌的最低抑菌濃度（MIC）。結果 各分離部位對不同菌株的抑菌效果有顯著差異，30%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌和志賀氏痢疾桿菌的抑制效果最好，MIC分別為0.055 g/mL和0.150 g/mL；而水洗液對肺炎鏈球菌桿菌的抑制效果最佳，MIC為0.184 g/mL，對金黃色葡萄球菌和志賀氏痢疾桿菌沒有抑制作用；水洗液、10%乙醇洗脫液、30%乙醇洗脫液對綠膿桿菌幾乎沒有抑制效果，極性稍小的50%乙醇洗脫液、70%乙醇洗脫液、90%乙醇洗脫液對綠膿桿菌有較弱的抑制效果。結論 五味消毒飲的不同分離部位對不同細菌的抑制效果不同，為經典方劑“五味消毒飲”的二次開發提供了理論依據和數據支持。

〔關鍵詞〕 五味消毒飲；NKA-9大孔樹脂；最低抑菌濃度；洗脫液

〔中圖分類號〕R285.5；R284.2 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.08.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the in vitro antibacterial activity of different separated parts of Wuwei Xiaodu Decoction， and to provide an experimental basis for the secondary development of Wuwei Xiaodu Decoction. Methods The water extract solution of Wuwei Xiaodu Decoction was absorbed and separated by NKA-9 macroporous resin to obtain the eluent of each part. The Oxford cup method was used to measure the inhibition zone， and the tube dilution method was used to measure the minimal inhibitory concentration （MIC） of the eluent. Results There was a significant difference in antibacterial effect on different strains between the separated parts. The 30% ethanol eluent had the best inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Shigella dysenteriae， with an MIC of 0.055 g/ml and 0.150 g/ml， respectively. The water extract had the best inhibitory effect on Streptococcus pneumoniae， with an MIC of 0.184 g/ml， while it had no inhibitory effect on Staphylococcus aureus and Shigella dysenteriae. The water extract， 10% ethanol eluent， and 30% ethanol eluent had little inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa， and 50% ethanol eluent with less polarity， 70% ethanol eluent， and 90% ethanol eluent had a weak inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa. Conclusion Different separated parts of Wuwei Xiaodu Decoction have a different inhibitory effect on different bacteria， which provide a theoretical basis and data support for the secondary development of the classic prescription Wuwei Xiaodu Decoction.

〔Keywords〕 Wuwei Xiaodu Decoction； NKA-9 macroporous resin； minimal inhibitory concentration； eluent

五味消毒飲是出自清代名著《醫宗金鑒》的經典名方，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，具有廣譜抗菌作用，在臨床上被廣泛應用于臨床各科中屬于熱毒所致的疾患，如內科泌尿系統、消化系統、呼吸系統、心腦血管系統等多種疾病，廣泛用于多種炎癥感染性疾病，如急性泌尿系統感染、帶狀皰疹、痤瘡或外科瘡癰癤腫等熱毒熾盛的疾病，均有良好效果[1-4]。

目前對五味消毒飲中單味藥的成分[5-6]，以及用大孔樹脂對君藥成分的吸附效果都已進行了深入研究，據報道NKA-9型大孔樹脂的吸附效果較好[7-8]。現代藥理學研究表明，五味消毒飲有廣譜抗菌作用[9]，并具有對細菌耐藥性低、調節免疫[10]等功效。

依據五味消毒飲的臨床應用研究[11-13]，本實驗研究了五味消毒飲水煎液的抗菌活性物質。我們選用于人類重要的革蘭氏陽性病原菌黃色葡萄球菌、最為常見的人類細菌性痢疾病原菌革蘭氏陰性桿菌志賀氏痢疾桿菌、能引起急性腸胃炎的乙型副傷寒桿菌、傷口感染較常見的綠膿桿菌以及對多種抗生素具備耐受性分布于人類上呼吸道、胃腸道、泌尿道及生殖道中的常見細菌肺炎鏈球菌共五種代表菌株。用NKA-9大孔樹脂對五味消毒飲的水提液進行分離，得到不同部位的洗脫液，研究其對五種代表菌株的抗菌活性，為五味消毒飲經典復方抗菌藥物的二次開發提供理論基礎和實驗依據。

1 材料

1.1 主要試劑與菌株

NKA-9型大孔樹脂，購自天津歐瑞生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，ATCC25923）、痢疾桿菌（Shigella.dysenteriae，ATCC12022）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）、乙型副傷寒桿菌（Bacillus paratyphosus，CMCC50094）和肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，ATCC49619），以上菌種均由湖南中醫藥大學病原免疫實驗室提供。

1.2 主要藥材

金銀花20 g，野菊花、蒲公英、紫花地丁、紫背天葵子各15 g。處方中金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥花蕾或帶初開的花；蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.的干燥全草；野菊花為菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥頭狀花序；紫花地丁為堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草；紫背天葵子為毛茛科物天葵Semiaquilegia adoxioieds（DC.）Makino的塊根。以上各藥材均購自老百姓大藥房，經湖南中醫藥大學藥學院周日寶教授鑒定。

2 方法

2.1 固體培養基的制備

營養瓊脂培養基的制備：MH瓊脂高壓滅菌后傾注于90 mm平皿，每個約25 mL，備用。

血平板培養基的制備：每500 mL雙蒸水中加入20 g營養瓊脂，高壓滅菌后，冷至56 ℃加入無菌綿羊血25 mL，混勻后傾倒于70 mm平皿中，備用。

2.2 大孔樹脂預處理

將NKA-9大孔樹脂用無水乙醇浸泡24 h，充分溶脹，加入乙醇清洗至洗出液無白色渾濁后，并加入蒸餾水洗至無乙醇。加入2倍樹脂柱體積（2BV）的5%NaOH溶液浸泡3 h，蒸餾水清洗至洗出液呈中性。最后加入2BV的5%鹽酸水溶液浸泡3 h，用蒸餾水清洗至洗出液呈中性后備用。

2.3 五味消毒飲水提液的制備

按5付方劑量稱取五味消毒飲生藥材（不粉碎），共計400 g，加入10倍量蒸餾水浸泡60 min，煎煮30 min，然后加入8倍量蒸餾水煎煮20 min，最后再加入6倍量蒸餾水煎煮20 min，合并3次濾液，65 ℃減壓濃縮至400 mL，得濃縮液（濃度為1 g/mL，每毫升溶劑含生藥材1 g），備用。

2.4 五味消毒飲各洗脫液的制備

將預處理好的NKA-9大孔樹脂10 g濕法裝柱，用95%乙醇和適量蒸餾水洗脫柱子，直至洗脫液無白色渾濁為止，水洗至無醇味。將五味消毒飲的濃縮液上柱吸附2 h，依次用2BV的蒸餾水，10%、30%、50%、70%、90%的乙醇進行洗脫，將洗脫液減壓濃縮，得到各濃縮液的濃度依次為1.47、2.60、3.49、1.20、3.62、2.70 g/mL（即每毫升溶劑含有的生藥材量）。

2.5 抑菌活性的測定

2.5.1 牛津杯法測定抑菌圈 將濃度為1×106 cfu/mL的待檢菌液均勻涂布于固體培養基上，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和志賀氏痢疾桿菌使用營養瓊脂平板，而肺炎鏈球菌和乙型副傷寒桿菌則均勻涂布于血平板上。將滅菌牛津杯用無菌鑷子夾出，先置于酒精燈火焰上迅速過一下火，垂直放置于培養基表面，輕輕按壓，使杯底與培養基之間無縫隙。每個平板放置4個牛津杯。每個牛津杯注入200 μL濃縮洗脫液，37 ℃培養24 h，量取抑菌圈的大小。

2.5.2 試管稀釋法測定5種細菌的最低抑菌濃度 每支無菌試管中加肉湯培養基l mL，第1管加所試藥液混勻后，使1～9管均含有倍比稀釋的洗脫液的比例分別為1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，每管加菌液0.05 mL（1×106cfu/mL），并設陰性對照組（MH液體培養基）和陽性對照組（加菌，不加藥液）。37 ℃條件下培養24 h，以不生長菌落的最高藥物稀釋濃度為對該種細菌的最低抑菌濃度（MIC）。

2.6 統計方法

五味消毒飲不同分離部位的抑菌圈數據以“x±s”表示，多組間數據的采用SPSS 19.0軟件進行χ2檢驗，P<0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 抑菌圈法定性檢測五味消毒飲分離部位的抗菌效果

從抑菌圈直徑分析，五味消毒飲不同分離部位對同一菌株的抑菌圈直徑存在很大差異，其中30%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌的抑制效果最強，結果如表1所示。對金黃色葡萄球菌：30%、10%、90%的乙醇洗脫液表現出明顯的抑菌活性，其中30%的乙醇洗脫液最強，而水洗液及50%、70%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌無抑制作用；對志賀氏痢疾桿菌：除水洗液及90%乙醇洗脫液外的其它分離部位都表現出抑菌活性（P<0.05），其中30%乙醇洗脫液最強，而水洗液及50%、70%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌無抑制作用；對志賀氏痢疾桿菌：除水洗液及90%乙醇洗脫液外的其它分離部位都表現出抑菌活性，其中30%乙醇洗脫液的抑菌活性最強，而10%和50%乙醇洗脫液相差不大，且強于70%乙醇洗脫液；對肺炎鏈球菌：只有90%乙醇洗脫液沒有抑制作用，其它分離部位的抑菌活性顯著（P<0.05）；對乙型副傷寒桿菌：水洗液、50%和30%乙醇洗脫液的抑菌圈直徑相差不大；對綠膿桿菌：70%乙醇洗脫液的抑制效果較好，但其抑菌圈較小實際意義不大。

同一分離部位對不同菌株的抑菌圈分析可知，30%乙醇洗脫液的對不同菌株的抑制效果差異最大：金黃色葡萄球菌>志賀氏痢疾桿菌>肺炎鏈球菌>乙型副傷寒桿菌>綠膿桿菌。而10%乙醇洗脫液的抑制效果：金黃色葡萄球菌>志賀氏痢疾桿菌（肺炎鏈球菌）>乙型副傷寒桿菌（綠膿桿菌）。水洗液對肺炎鏈球菌和乙型副傷寒桿菌的抑制效果較好。50%乙醇洗脫液對志賀氏痢疾桿菌、肺炎鏈球菌、乙型副傷寒桿菌的抑制作用沒有明顯差異，但強于對綠膿桿菌的抑制作用。70%乙醇洗脫液對志賀氏痢疾桿菌和肺炎鏈球菌的抑制效果相差不大，但強于對綠膿桿菌的抑制效果。90%乙醇洗脫液只對金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌有抑制作用，且對前者的抑制作用明顯強于后者。

3.2 MIC定量比較五味消毒飲分離部位的抗菌效果

依據“3.1”項的實驗結果，對抑菌效果較好的分離部位用試管稀釋法確定其MIC，每個實驗重復5次，結果如表2所示。MIC數據顯示，每種分離部位對不同菌株的抑制作用不同，水洗液對肺炎鏈球菌的抑制效果強于對乙型副傷寒桿菌的抑制作用（P<0.05）。10%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌的抑制作用強于對肺炎鏈球菌和乙型副傷寒桿菌，但效果明顯小于30%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌、志賀氏痢疾桿菌的抑制作用，后者MIC分別為0.055 g/mL、0.109 g/mL。50%乙醇洗脫液對志賀氏痢疾桿菌的MIC為0.150 g/mL，抑制作用強于對其它菌株的抑制作用（P<0.05）。70%乙醇洗脫液的抗菌活性明顯較差（P<0.05），其中對志賀氏痢疾桿菌的MIC最小，為0.453 g/mL。90%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌有抗菌效果較明顯，MIC為0.338 g/mL。

4 討論

五味消毒飲中的君藥為金銀花，具有清熱解毒、消散癰腫的功效。紫花地丁、紫背天葵子具有清熱解毒、消散疔瘡的作用，蒲公英、野菊花具有清熱解毒、消散癰腫的功效，這四味均為輔佐藥，各藥合用，增強清熱解毒的功效。本實驗中復方水煎液的30%乙醇洗脫液對金黃色葡萄球菌的抗菌效果最強，文獻報道金銀花單味藥的黃酮成分金絲桃苷，對于金黃色葡萄球菌的作用很強[14]。而且金絲桃苷只有一個六元糖極性較大，所有在五味消毒飲中30%乙醇洗脫液中的含量相對較高，所以對金黃色葡萄球菌的抗菌效果最強，充分說明君藥金銀花在復方中起的重要作用。綠原酸是金銀花的主要抗菌成分，其對綠膿桿菌藻酸鹽的大量產生，降低生物膜的復雜性，并減小生物膜的產生。與抗生素聯合使用效果更加，能明顯減小綠膿桿菌耐藥性的產生[15]。而在本實驗中由于提取濃縮五味消毒飲時間較長，可能會破壞其綠原酸的結構，從而導致各提取部位對綠膿桿菌的抑制效果很差。

實驗結果證明，同一分離部位對不同菌株，以及不同分離部位對同一菌株，均有差異。其中，30%乙醇洗脫液的對金黃色葡萄球菌和志賀氏痢疾桿菌抗菌效果最好，抑菌效果隨藥液濃度的增大而增強。對金黃色葡萄球菌的MIC為0.055 g/mL，對志賀氏痢疾桿菌的MIC為0.109 g/mL。濕疹患者的患部大多數（80%）細菌培養陽性，并且全部是葡萄球菌屬[16]，其中金黃色葡萄球菌最多，因此五味消毒飲的30%乙醇洗脫液分離部位有希望開發為治療濕疹的藥物。而極性較大的水洗液部位對金黃色葡萄球菌抗菌、志賀氏痢疾桿菌、綠膿桿菌沒有抑菌效果，對乙型副傷寒桿菌效果較好，對肺炎鏈球菌的抑制效果最佳，隨濃度升高抑菌效果增強，MIC為0.184 g/mL，因此五味消毒飲的大孔樹脂水洗液部位更利于抗呼吸系統和消化系統感染藥物的開發。五味消毒飲復方水煎液各分離部位的具體抗菌成分及抗菌機制有待深入研究。

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