生物檢測技術PCR及其在獸醫微生物檢測中的應用

何旭 孫代鵬

摘要：目前，在生物檢測技術當中所采用的PCR技術，是一種基于聚合酶鏈式反應的技術手段，也被稱為無細胞分子克隆系統技術。首先對現階段PCR生物檢測技術的基本原理和特征進行簡述，并以此為基礎，總結分析了PCR技術在獸醫領域微生物檢測當中的應用方法，從而探究技術的發展方向。

關鍵詞：微生物檢測;生物檢測技術;PCR;發展

中圖分類號：S852.2

文獻標識碼：B doi： 10.3969/j.issn.2096-3637.2018.08.007

0 前言

PCR技術最早出現于1985年的美國getus公司，這種技術檢測方法在特定的DNA片段當中能夠進行微量擴散，從而達到檢測目的。在研究領域，PCR技術較高的靈敏度和特異性特點。隨著技術發展與創新，目前PCR技術應用更加廣泛，除了在基因克隆方面得到長足應用外，在獸醫領域的治療診斷中，也得到了充分的運用。因此，探究PCR技術，對實現微生物的精準檢測意義十分重大。

1 PCR技術的原理與應用特征

1.1 PCR技術原理

在已知技術的作用下，各種DNA片段序列會得到有效擴增，再加上人工合成DNA片段的相互作用，可以在兩條鏈的末端進行互補，從而將核苷酸引物突顯出來，在該種方式的作用之下，待檢DNA序列在酶的作用下會出現擴增，該項技術也被人們稱之為PCR技術。通俗意義上來講，PCR就是體外人工選擇性擴增DNA的一種方法，它類似于生物體內的DNA的復制。在整個反應過程之中，DNA模板會經歷變性、退火和延伸3個過程，并由若干個循環序列組成。首先，在高溫作用下，DNA模板會出現變性解鏈，之后在通過降溫，促使寡核苷酸和模板DNA鏈在三端出現退火現象。另外，在聚合酶的作用下，有4種DNTP底物存在，并在模板互補過程中形成新的鏈條。除此之外，在單一拷貝過程中，基因可以將25～ 30作為基數，最終擴展到100萬～200萬之間[1]。在擴增后期，由于產物積累，使原來呈指數擴增的反應變成平坦的曲線，產物不再隨循環數而明顯上升，這稱為平臺效應。平臺期會使原先由于錯配而產生的低濃度非特異性產物繼續大量擴增，達到較高水平。因此，應適當調節循環次數，在平臺期前結束反應，減少非特異性產物。到達平臺期所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝[2]。

1.2 PCR技術特征

在PCR反應結束之后，便會產生新的引物，這種還包括各種聚合酶及緩沖液，其基本技術特征主要集中的以下幾方面：首先是引物，在DNA片段擴增過程中，主要涉及到寡核苷酸作用下，PCR擴展特性中的關鍵因素得到了有效突顯，在引物設計過程中，還能對PCR擴展成效進行突顯。一般來說，由于堿基在鏈條之中的不斷重復，引物間的Tm將會與標準值更加接近，避免GC含量出現過高情況。其次是DNA聚合物特點，截止到目前，PCR在擴展之中可以對DNA聚合酶進行充分應用，且應用類型為TagDNA，該類型主要在水生棲熱菌作用下產生，具有極強的熱穩定性。如果PCR的擴展能力較高，便會對具體的DNA特性產生影響。一般來說，在100 uL反應體系的作用下，2單位的PCR技術將會得到有效應用。另外，由于耐熱聚合酶在RNA反轉錄過程中大量增加，操作程序出現較大簡化，從而實現轉錄效率的進一步提升。最后，為了將檢測效率進行提升，相關研究人員對緩沖液進行了積極應用，在此過程中，緩沖液的主要類型為10～50 mol的HCI體系，切記不能將Tag酶和緩沖液較差使用[3]。

2 PCR技術在曾醫微生物檢測中的應用

通過對獸醫微生物檢測工作的分析可知，傳統方法用于微生物監測，步驟十分繁瑣，且局限性較強，具體表現為：這種檢測方法要求待測樣品經被檢測微生物富集培養一段時間后，直至微生物數量達到既定的相應水平，方可分離并進行檢測。相比之下，PCR技術則可有效避免上述弊端，在獸醫微生物檢測中，這種檢測技術僅需通過特定的核苷酸引物，快速分析并確定樣本中的微生物種類[4]。

在實際檢驗過程中，具體檢測流程為：提取細菌靶DNA，采用過濾處理方法或離心處理方法，從待檢樣品中分離出細菌細胞;對細菌細胞進行裂解處理，經過核酸純化處理后，為后續檢驗奠定基礎。除了這種方法，出于便捷性目的，還可以通過直接裂解待檢樣品中細菌細胞的方式，抽提其中所在的核酸。以大腸桿菌檢測為例，在傳統檢測模式下，需將待檢牲畜樣品、細菌置于含乳糖的革蘭陰性菌環境下，持續培養一段時間后，再進行分離，最后進行檢測。整個大腸桿菌檢測耗時3～5d，甚至更長，且檢測方法相對繁瑣，一旦其中一個環節出現問題，可能導致最終檢測結果受到影響。而在獸醫大腸桿菌檢測中引入PCR技術后，整個檢測流程被簡化為：根據大腸桿菌類，設計適宜的PCR反應序列，利用PCR、擴增樣本中的uidA基因、lacZ基因，此時，即可檢出樣本中的大腸桿菌以及大腸桿菌類[5]。

雞養殖是我國養殖行業的主要構成。隨著養殖業的不斷發展，雞病問題逐漸受到人們的重視。為了保障養殖行業的良性發展，可引入PT-PCR技術，具體檢測流程如下：為雞胚接種病毒，制取適量雞胚尿囊液標本，從其中提純RNA，按照規范流程完成CDNA的制備，建立PCR反應序列并進行反應，再次進行雞胚接種后，可獲取充足的雙股RNA片段，且該RNA片段特征具有可克隆特征，為病雞死亡率的控制提供良好的技術支持。

目前，PCR技術已經在各個生物領域得到初步的應用，從而衍生出比較新穎的技術形式。通過PCR與其他技術的聯用還可以解決生產技術的難題。但在實際操作與運用過程中還存在一些問題。例如：水產動物養殖生產者缺乏實驗設備或實驗設備不夠先進、DNA萃取過程不當、實驗試劑上的問題等，這些情況容易使檢測的結果不夠理想，失去生物檢測原有的意義[6]。快速、簡便、靈敏的PCR檢測方法為水產養殖動物的疾病診斷帶來希望。隨著PCR技術的不斷完善以及與其他新技術的聯合應用，將會極大地推動畜牧及水產養殖業的有效發展[7]。

3 結束語

綜上所述，在目前的生物檢測技術手段當中，PCR技術以其獨特的精準度優勢在獸醫微生物檢測領域得到了充分的運用。而技術手段方面，檢測人員中需要將多試劑進行試管液相雜交，就可以完成較高靈敏度的快速診斷，最終提升檢測診斷效率。

參考文獻

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