白及小分子熱激蛋白BsHsp17.3基因的克隆與表達分析

江愛明 蔡高磊 曹俊 周向宇 柯尊偉

摘 要： 為了探索人工栽培白及的適宜條件，該研究以湖北省十堰市野生白及為對象，采用同源克隆和3′RACE技術，從白及（Bletilla striata ）中獲得與熱激蛋白合成有關的BsHsp17.3基因，并分析BsHsp17.3基因對不同脅迫的響應。結果表明：BsHsp17.3基因開放閱讀框長度為453 bp，編碼150個氨基酸；蛋白的分子量為17.42 kD，等電點為6.33。進化樹分析表明BsHSP17.3蛋白與同為蘭科的鐵皮石斛進化關系較近，同在一分支上。半定量RT-PCR分析顯示BsHsp17.3基因在白及根、葉、鱗莖及花組織中的表達具有特異性，且BsHsp17.3基因在葉中的表達量較高，在鱗莖及花中不表達。實時熒光定量PCR檢測顯示BsHsp17.3對非生物脅迫高溫、低溫具有明顯應答反應，20%PEG模擬干旱脅迫不誘導該基因表達，推測該基因在白及防止倒苗過程中可能發揮一定作用。

關鍵詞： 白及， BsHsp17.3， 克隆， 熒光定量PCR

中圖分類號： Q943.2 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-3142（2018）09-1191-08

Abstract： BsHsp17.3 gene was isolated from Bletilla striata using homologous cloning and 3′RACE methods. In this study， the expression profiles of BsHsp17.3 under different stresses were analyzed and suitable conditions were explored for artificial cultivation of B. striata. The results were as follows： The opening reading frame of BsHsp17.3 was 453 bp， which encoded a 150-amino acid peptide. Its protein molecular weight and isoelectric point were 17.42 kD and 6.33. Phylogenetic analysis demonstrated that BsHsp17.3 was closed to the Hsp17.3 from Dendrobium catenatum. Quantitative real-time PCR analysis showed that the expression of BsHsp17.3 was different in leaf， root， bulb and flower of B. striata. The expression level of BsHsp17.3 gene was the highest in leaf and root，respectively， but was absent from the bulb and flower. The expression of BsHsp17.3 was analyzed by quantity RT-PCR under cold， hot and drought treatments. The results showed that the expression of BsHsp17.3 quickly induced by high temperature and cold， but drought stress simulated by 20% PEG did not regulate the gene expression. These results suggest that BsHsp17.3 may be involved in regulating sprout tumble of Bletilla striata.

Key words： Bletilla striata， BsHsp17.3， clone， quantity RT-PCR

白及（Bletilla striata），為多年生草本球根植物，植株高18～60 cm，葉呈狹長圓形或披針形，花大色艷，種子極細小，似粉末，沒有胚乳。假鱗莖扁球形，肥厚肉質，數個相接可入藥，有收斂止血、清熱解毒、消腫生肌之功效，具有較高的藥用價值和觀賞價值。白及耐陰懼曬，常生長于較濕潤的石壁、苔蘚層中，與灌木相結合。每年6—9月、12月至次年1月，溫度較高和較低，白及地上部分植株枯萎、倒伏，進行倒苗，這是白及抵御高溫和低溫一種適應性表現。但是，倒苗縮短了白及的生長期，嚴重影響了白及的產量， 因此防倒苗是一項非常重要的增產措施（黎君等，2016）。

在高溫脅迫下，植物細胞中的各種酶因變性喪失功能。為了消除高溫脅迫所造成的傷害，植物細胞內具有對損傷蛋白進行修復和清除的機制（Bouchard，1990；Guo et al，2015）。其中，熱激蛋白（heat shock protein，HSP）是細胞在高溫脅迫下產生的一類蛋白質，它主要作為分子伴侶，輔助蛋白質正確折疊和運輸，維持蛋白的構象和功能穩定（Pegoraro et al，2011；Sarkar et al，2009）。根據分子量大小可將植物熱激蛋白分成HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40和小分子量熱激蛋白。小分子熱激蛋白的分子量在12～45 kD之間，也是保守性最低的一類熱激蛋白（Sun et al，2001，2002；Yang et al，2017）。研究發現小分子熱激蛋白基因在種子發育過程中受高溫和滲透脅迫誘導表達，超表達該基因能增強植物對干旱、高溫、鹽和UV-B 的抗性（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孫愛清等，2015）。本研究以湖北省十堰市野生白及為研究對象，克隆小分子熱激蛋白基因BsHsp17.3，并對其組織特異性及生長過程中主要面臨的3種不同脅迫條件進行處理，通過實時熒光定量PCR檢測該基因的表達情況，為白及人工栽培溫度調控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

野生白及種子采自湖北省十堰市境內，地理位置為110°85′ E、32°97′ N，海拔315.6～352.2 m，將采集的新鮮種子消毒滅菌后直播于培養基上進行萌發，將5月齡白及植株馴化移栽于漢江師范學院生化系人工氣候室。

1.2 方法

1.2.1 白及逆境脅迫處理 對5葉齡白及植株分別進行0 ℃、35 ℃， 20%PEG模擬干旱脅迫處理0、0.5、2、8、12 h，脅迫處理結束后取植株的完全展開葉片，于液氮中保存，用于基因表達特性分析。

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 剪取生長健康的葉片用于葉片總RNA提取（TRIzol法），反轉錄成cDNA，用于克隆BsHsp17.3基因。

1.2.3 BsHsp17.3基因的克隆 根據NCBI數據庫中已公布的煙草Hsp17.3基因（LOC107832104）序列設計上游引物Hsp17.3-F和下游引物Hsp17.3-R，以總RNA為模板，按照 PrimeScriptTM Double Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Code No.6111A）的操作說明合成cDNA。PCR反應體系為20 μL，包括1 μL cDNA模板，0.2 μL Pyrobest DNA Polymerase， F Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL， R Primer（20 μmol·L-1）0.15 μL，10×Pyrobest Buffer II 2 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，dH2O 16.3 μL。反應程序為98 ℃預變性2 min，30個循環（98 ℃、10 s，60 ℃、15 s，68 ℃、30 s），擴增產物回收后測序。

采用3′-full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒（TaKaRa Code No.6106），利用3′RACE Outer Primer和3′RACE Inner Primer擴增出完整的BsHsp17.3基因。用含有Gold view的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物。回收后的PCR產物連接到pMDTM18-T載體上，委托Takara進行DNA測序。所用引物見表1。

1.2.4 BsHsp17.3基因的序列比對及系統發育分析 采用BioXM2.6軟件對BsHsp17.3基因的可閱讀框長度進行預測，并翻譯成對應的氨基酸序列；用在線軟件SWISS-MODEL分析蛋白質相對分子量、等電點和結構域；利用NCBI數據庫中的BLAST進行同源序列分析；采用DNAMAN軟件對BsHSP17.3氨基酸序列進行多重比對；選取來源于19個不同植物的HSP17.3蛋白（表2），采用MEGA5軟件的鄰接法（NJ）構建蛋白質序列系統發育樹，并編輯成圖。

1.2.5 BsHsp17.3基因組織特異表達分析 利用Trizol法分別提取白及的根、鱗莖、葉、花組織總RNA，并反轉錄成cDNA，方法見 BsHsp17.3基因的克隆。以白及28sRNA（GeneBank登錄號： NC_028422.1）為內參基因，內參基因引物為QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。利用Hsp17.3-F和Hsp17.3-R對不同的樣品進行半定量RT-PCR擴增，分析該基因在不同組織中的表達情況。

1.2.6 BsHsp17.3基因在不同脅迫條件下的表達情況分析 實時熒光定量PCR采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒（TaKaRa），相對定量使用參照基因的ΔCT，ΔCT=CT目標基因-CT28s。根據克隆到的BsHsp17.3基因序列設計熒光定量檢測引物QBsHsp17.3F和QBsHsp17.3R（表1），以白及28sRNA為內參基因，內參基因引物為QBs28sRNA-F和QBs28sRNA-R。qRT-PCR擴增體系、擴增程序參照試劑盒說明書進行。將生長良好的白及幼苗分別置于0 ℃、35 ℃，20%PEG模擬干旱脅迫處理0、0.5、2、8、12 h。分別提取上述葉片的總RNA，采用實時熒光定量PCR技術檢測BsHsp17.3基因在不同脅迫處理下的相對表達量，每份樣品3次重復，數據通過2-ΔΔCT 方法分析。數據統計分析采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0軟件。

2 結果與分析

2.1 BsHsp17.3基因的克隆與序列分析

采用RACE技術，從白及葉片中得到一條約500 bp的擴增產物（圖1），將克隆得到的目的條帶進行測序。測序結果顯示目的基因長度為527 bp，通過分析顯示該基因的開放閱讀框為453 bp，可編碼150個氨基酸，將其命名為BsHsp17.3。為了解BsHsp17.3蛋白的生物學活性及潛在功能，利用在線軟件SWISS-MODEL對BsHSP17.3蛋白的理化性質和結構域進行分析和預測，結果顯示BsHsp17.3蛋白的分子量為17.42 kD，等電點為6.33。該蛋白含有熱休克ACD核心區域，一段是Pro-X（14）-Gly-Val-Leu，另一段是Pro-X（13）-Val/Leu序列，中間被親水的片段隔開（圖2）。將獲得的BsHsp17.3翻譯成氨基酸序列進行Blast搜索，結果發現該蛋白與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）HSP17.3（登錄號為XP_020678819.1）蛋白具有54%的相似性；與亞洲棉（Gossypium arboreum）HSP17.3（登錄號為XP_017639609） 蛋白具有49%的相似性；與蓖麻（Ricinus communis）HSP17.3 （登錄號為XP_002520483）蛋白具有48%的相似性（圖3）。

2.2 HSP17.3的分子系統發育分析

為了進一步研究HSP17.3的進化關系，將BsHSP17.3氨基酸序列與其他18種植物的HSP17.3氨基酸構建系統進化樹（圖4）。圖4結果表明：同為蘭科的鐵皮石斛、蝴蝶蘭與白及進化關系較近，同源性較高。不同科植物中的HSP17.3氨基酸進化較保守，如大戟科的蓖麻和麻瘋樹在同一分支上，豆科的大豆、樹豆和蔓花生在同一分支上，茄科的辣椒、煙草和野生煙草在同一分支上，錦葵科的亞洲棉和陸地棉在同一分支上，

2.3 BsHsp17.3基因在不同組織中的表達分析

利用Trizol法分別提取白及的根、鱗莖、幼葉、花組織總RNA，并反轉錄成cDNA，以白及28sRNA為內參基因，通過半定量RT-PCR檢測BsHsp17.3基因在不同組織中的表達情況。圖5結果表明，BsHsp17.3基因在白及幼葉和根中進行表達，在鱗莖和花中不表達。

2.4 BsHsp17.3基因在逆境處理下的表達特征分析

利用實時熒光定量PCR檢測BsHsp17.3基因在逆境處理下的表達特征。圖6結果表明，在0 ℃低溫脅迫下，處理0.5 h時，BsHsp17.3基因相對表達量快速上升達到最高，隨著處理時間延長相對表達量逐漸減少，到12 h時與對照非常接近。這說明BsHsp17.3基因能快速響應低溫脅迫，誘導表達上調，但隨著時間推移，基因的表達會被抑制，mRNA被降解。在35 ℃高溫脅迫下，BsHsp17.3基因表達情況和低溫脅迫較相似。在處理0.5 h時，BsHsp17.3基因相對表達量快速上升達到最高，隨后信號逐漸減弱。BsHsp17.3基因在20%PEG模擬干旱脅迫條件下相對表達量沒有顯著上升，且隨干旱脅迫時間延長，該基因表達沒有顯著變化。上述研究表明BsHsp17.3基因在低溫以及高溫脅迫時表達量均會上調，該基因在植物防御低溫及高溫脅迫中發揮一定作用。

3 討論

誘導型熱激蛋白的累積決定著真核生物細胞的耐熱性。在熱激條件下，生物體大部分正常蛋白的合成受到抑制，熱激蛋白開始合成，合成的熱激蛋白可保護機體蛋白質免遭損傷或修復已受損傷的蛋白質，從而對生物體起到保護作用（Ruibal et al，2013）。小分子熱休克蛋白（sHSPs）單體都比較小，大小介于15～42 kD之間，核心區域是含有100個氨基酸左右的α-晶體蛋白區域。大分子量的熱休克蛋白是目前發現的最保守蛋白之一，它在親緣關系較遠的物種中也保持較高的同源性，為60%～80%（Ruibal et al，2013；Chauhan et al，2012）。但是，小分子熱休克蛋白的保守性較低。在擬南芥中發現，sHSPs家族（sHSP17、sHSP20、sHSP22）的同源性低于50%（阮文進等，2016；Murakami et al，2004）。同種類型的sHSP在不同物種中的同源性也較低，水稻中的sHSP21與擬南芥、煙草和大豆中的sHSP21同源性都低于52%（Gustavsson et al，2002；Kaur et al，2015）。本研究也證實了這一結論，BsHsp17.3與鐵皮石斛HSP17.3蛋白具有較高的同源性，才達到54%的相似性，與亞洲棉、蓖麻中的HSP17.3蛋白同源性都低于50%。小分子熱激蛋白家族C端α-晶體蛋白稱為熱休克ACD區域，這一區域具有較高的保守性（楊貴燕等，2015；Sun et al，2012；Ruibal et al，2013）。ACD區域含有兩端序列，分別為Pro-X（14）-Gly-Val-Leu和Pro-X（14）-X-Val/Leu，兩端序列被親水氨基酸片段隔開，白及Hsp17.3蛋白結構也證實了這一觀點（孫愛清等，2015；Ruibal et al，2013）。

sHSP作為植物熱激蛋白家族的重要一員，對于維持細胞內蛋白的正確構象，避免蛋白的聚集有重要作用。與大多數熱激蛋白基因類似，sHSPs不僅能響應熱刺激，而且能響應低溫、重金屬、紫外輻射和高鹽脅迫等（Sun et al，2001；Zou et al，2012；孫愛清等，2015）。將35S CaMV 啟動子驅動的番茄葉綠體小分子熱激蛋白cDNA 導入番茄表明，葉綠體小分子熱激蛋白的過量表達提高了植物抗寒性（Wang et al，2005）。過量表達葉綠體HSP21 基因也能增強擬南芥的強光和高溫脅迫抗性（Zhang et al，2013，2014；Siddique et al，2008）。還有研究表明，小分子熱激蛋白與植物細胞的減數分裂有關（蘇晴等，2013）。轉OsHSP18.2基因的擬南芥種子能夠通過減少ROS積累的毒害從而提高種子活力和壽命（Zhao et al，2014；朱麗偉等，2016）。在核桃中瞬時過表達JrsHsp17.3能顯著提高株系的SOD、POD等酶的活性，從而抵抗低溫、高溫和高鹽脅迫（楊貴燕等，2015）。從白及中分離的BsHsp17.3基因與其他小分子熱激蛋白表達特性是一致的，能夠快速響應高溫脅迫，其誘導表達水平受到脅迫溫度和時間的影響。脅迫溫度越低或越高，基因表達響應越快，并且基因的表達不會隨脅迫時間的延長而積累。在PEG模擬干旱脅迫下，BsHsp17.3基因表達沒有顯著變化，可能是因為白及鱗莖中積累了大量的多糖，提高了細胞內的滲透壓，阻止了細胞內水分的喪失，這也是BsHsp17.3基因在鱗莖中不表達的原因。

白及具有重要的藥用價值。在高溫和低溫情況下，白及地上部分植株枯萎進行倒苗，這大大縮短了白及的生長周期，減緩了白及鱗莖的生長。對白及BsHsp17.3基因表達分析的研究有助于人工栽培白及溫度條件的控制，縮短倒苗的時間，起到增產增收的經濟效益。植物抗逆是一個復雜的綜合反應機制，小分子熱激蛋白參與了非生物脅迫的過程，在細胞內通過何種信號轉導途徑引起BsHsp17.3基因的表達，還有待進一步的研究。

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