自發性高血壓大鼠左心室肥厚的蛋白質譜研究

劉培 肖隋熙 羅穎 陳偶英 劉天洋 郭心鴿 譚元生 簡維雄

〔摘要〕 目的 研究自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）左心室肥厚心肌組織的蛋白質變化。方法 對8只SHR與8只WKY大鼠組織蛋白質進行iTRAQ檢測分析；通過對差異蛋白Pathway富集分析選擇與通路相關的蛋白質。結果 篩選出與通路相關的40個差異蛋白，SHR與WKY比較上調的差異蛋白有：1主要組織相容性復合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有絲分裂原蛋白激酶、4熱休克27kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纖維蛋白原、8蛋白酶體26S、9纖維蛋白原γ鏈、10中性膽固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰轉移酶、12纖連蛋白。下調的差異蛋白有：13絲氨酸蛋白酶、14載脂蛋白H、15血清鋅α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22鈉鉀ATP轉移酶、23膠原蛋白、24集聚蛋白、25對羥基苯丙酮酸雙氧化酶、26C反應蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29胎球蛋白、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重鏈γ多肽、34轉膠蛋白、35血紅蛋白-α。結論 SHR左心室肥厚發生涉及心肌凋亡、細胞增殖增生、炎癥等多種細胞因子，導致細胞損傷與保護作用失衡。

〔關鍵詞〕 自發性高血壓大鼠；左心室肥厚；蛋白質組學

〔中圖分類號〕R544.1；R393 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.001

〔Abstract〕 Objective To study the protein changes in the myocardium of left ventricular hypertrophy in spontaneously hypertensive rats （SHR）. Methods The protein of 8 SHR and 8 WKY rats were detected and analyzed by iTRAQ detection and analysis technique. The proteins related to pathway were selected by enrichment analysis of differential protein pathway. Results The 40 differential proteins related to pathways were screened. Upregulated proteins in SHR compared with WKY： 1 major histocompatibility complex， 2 platelet activating factor acetylhydrolase， 3 mitogen activated protein kinase， 4 heat shock protein 27 kDa， 5 Ighg 3， 6 14-3-3 protein gamma， 7 ibrinogen， 8 fibrin and 26 S proteasome， 9 the original gamol/La chain， 10 neutral cholesteryl ester hydrolase， 11 hemolytic PAF acetyltransferase， 12 fibronectin. Down regulated differentially proteins： 13 serine protease， 14 apolipoprotein H， 15 serum zinc alpha 2 glycoprotein， 16 ubiquinone 9， 17 ubiquinone 7， 18 alpha 2-AP， 19 kininogen， 20 heparin cofactor 2， 21 unknown protein， 22 sodium-potassium ATP transferase， 23 collagen， 24 agrin， 25 concentration of HPPD， 26 C reactive protein， 27 integrin， 28 coagulation factor XII， 29 fetuin 30 integrin alpha 7， 31 carbonic anhydrase， 32 CD36， 33 immune globulin heavy chain gamma polypeptide， 34 transgelin， 35 hemoglobin alpha. Conclusion Left ventricular hypertrophy in SHR involves many kinds of cytokines， such as myocardial apoptosis， cell proliferation， proliferation， inflamol / Lation and so on， leading to the imbalance of cell injury and protection.

〔Keywords〕 spontaneously hypertensive rats； left ventricular hypertrophy； proteomics

自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是研究高血壓疾病的經典鼠種，研究發現在第14周齡時，SHR的左心室質量和左心室質量指數已經顯著高于對照組，說明此時左室肥厚已經基本形成[1]。人體和各種生命物質是由蛋白質組成的，為了從整體角度分析左室肥厚時細胞內生命過程中動態變化的蛋白質組成、表達水平、修飾狀況、蛋白質之間以及蛋白質與其它生物分子之間的相互作用。本項目應用相對和絕對定量同位素標記（iTRAQ）技術展開對左心室肥厚干預的蛋白質組學研究。

1 材料

1.1 動物

選用SPF級12周齡自發性高血壓大鼠（SHR） 8只，雄性，同齡血壓正常的（wistar-kyoto，WKY）大鼠8只，雄性，質量180～220 g，大鼠及飼料均由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供（SHR大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格編號：20141020，飼料購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司），飼養環境溫度（20.0±2.0） ℃，相對濕度45%～70%。自由飲食飲水，早8點至下午5點自動燈光照明。

1.2 試劑

Trypsin（Promega公司，美國），三乙胺碳酸氫鹽（Applied Biosystem公司，意大利），TEAB（Applied Biosystem公司，意大利），乙腈（Sigma公司，美國），甲酸（Sigma公司，美國），2-D Quant Kit（GE Healthcare公司，美國），8標iTRAQ試劑（Applied Biosystem公司，意大利）。

1.3 儀器

離心機（德國，Eppendorf公司），Milli-Q Advantage超純水系統（美國，密理博），precellys24多功能生物樣品均質器（法國，Bertin），VCX130超聲波細胞粉碎機（美國，Sonics），Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直電泳槽（美國，伯樂），powerlook2100xl 掃描儀（美國，UMAX），iMark酶聯免疫吸附儀（美國，伯樂），SCX強陽離子交換液相色譜柱（美國，菲羅門公司），LC-20AD nanoHPLCOnline HPLC（日本，島津公司），C-20AB HPLCOffline HPLC（日本，島津公司），Q EXACTIVE質譜儀（中國，賽默飛世），Q-EXACTIVE （ThermoFisher Scientific，San Jose，CA）。

2 方法

2.1 蛋白制劑

2組大鼠處死后，分別剪取心臟左心室部分，每個樣本剪碎后稱取30 mg，用Lysis Buffer含有1 mol/L PMSF和2 mol/L的EDTA（終濃度）萃取。5 min后，10 mol/L DTT（終濃度）加入到樣品中。將懸浮液進行超聲處理，在200 W15 min，然后在4 ℃，30 000 g離心15 min，上清充分混合，上清加入5倍體積預冷丙酮，在-20攝氏度沉淀2 h，離心在4 ℃下，30 000 g后，棄去上清液。將沉淀物用冷凍丙酮3次。將沉淀風干，溶解于裂解緩沖液。將懸浮液進行超聲處理，在200 W15 min，并在4 ℃，30 000 g離心15 min。將上清轉移到另一管中。上清液在56攝氏度條件下加入終濃度10 m MDTT處理1 h，還原打開二硫鍵。隨后，加入55 mol/L IAM（終濃度）進行半胱氨酸的烷基化封閉，在暗室孵育1 h。上清充分混合，用5倍體積冷卻的丙酮2 h在-20 ℃以沉淀蛋白質。在4 ℃下，30 000 g離心 后，棄去上清液，將沉淀物風干5 min，溶解在500 μL的0.5 mol/L的三乙胺碳酸氫鹽中（Applied Biosystems，米蘭，意大利），并超聲處理在200 W 15 min。最后，將樣品在4 ℃，30 000 g離心15 min。將上清液轉移到新管中并定量。上清液中的蛋白質被保存在-80 ℃用于進一步分析。

2.2 分離部分iTRAQ標記和SCX分級

每個樣品精確取出100 μg蛋白，然后按蛋白∶酶=30∶1的比例加入Trypsin，37 ℃酶解4 h。按上述比例再補加Trypsin1次，37 ℃繼續酶解16 h。

胰酶消化后，肽通過真空離心干燥。樣品標記用的iTRAQ標簽如下：SHR（115標記），WKY組（113標記）。將肽標記的同量異序標記，在室溫下孵育2 h。將標記后的各組肽段混合，用SCX柱進行液相分離。

采用島津LC-20AB液相系統、分離柱為4.6 mm×250 mm型號的UltremexSCX柱對樣品進行液相分離。將標記后抽干的混合肽段用4 mL bufferA（25 mol/L NaH2PO4 in 25%ACN，pH2.7）復溶。進柱后以1 mL/min的速率進行梯度洗脫：先在5% buffer B（25 mol/L NaH2PO4，1 mol/L KCl in 25%ACN，pH2.7）中洗脫7 min，緊跟著一個20 min的直線梯度使buffer B由5%上升至60%，最后在2 min內使buffer B的比例上升至100%并保持1 min，然后恢復到5%平衡10 min。整個洗脫過程在214 nm吸光度下進行監測，經過篩選得到12個組分。每個組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。

2.3 質譜鑒定

將抽干的每個組分分別用buffer A（2% ACN，0.1% FA）復溶至約0.5 μg/μL的濃度，20 000 g離心10 min，除去不溶物質。每個組分上樣10 μL（約5 μg蛋白），通過島津公司LC-20AD型號的納升液相色譜儀進行分離。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱兩部分。分離程序如下：先以8 μL/min的流速在4 min內將樣品loading到Trap柱上，緊接著一個總流速為300 nL/min的分析梯度將樣品帶入分析柱，分離并傳輸至質譜系統。先在2% bufferB（98% ACN，0.1% FA）下洗脫5 min，跟著一個35 min的線性梯度使bufferB的比例由2%上升至35%，在接下來的5 min內提高到60%，然后在2 min內buffer B增加到80%并保持4 min，最后在1 min內恢復至5%并在此條件下平衡10 min。

經過液相分離的肽段進入到串聯ESI質譜儀：Q-EXACTIVE（ThermoFisher Scientific，San Jose， CA）。一級質譜分辨率設置為70 000，二級分辨率為17 500。在母離子中挑選電荷為2+～5+，峰強度超過20 000的15個母離子進行二級分析，用碰撞能量為（27±12）%的HCD模式對肽段進行碎裂，碎片在Orbi中檢測，動態排除時間設定為：色譜半峰寬時長。離子源電壓設置為1.6 kV。AGC通過orbi來實現，其設置為：一級3E6到二級1E5。掃描的質荷比范圍為一級350～2 000，二級100～1 800。

2.4 蛋白質分析方法

2.4.1 數據庫選擇 Uniprot Rattus（36508sequences）。

2.4.2 Mascot搜索 采用Mascot 2.3.02版本，操作時以mgf文件為原始文件，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。

2.4.3 蛋白質豐度比分布 在相對定量時，如果同一個蛋白質的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質豐度比接近于1。當蛋白的豐度比即差異倍數達到1.2倍以上，且經統計檢驗其p-value值小于0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。對每個蛋白質差異倍數以2為底取對數后作出分布如圖1。表達量上調的蛋白居于橫坐標0位置的右側，表達量下調的蛋白居于橫坐標0位置的左側。

2.4.4 差異蛋白的Pathway富集分析 Pathway顯著性富集分析方法同GO功能富集分析，是以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的Pathway。通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

3 結果

3.1 肽段匹配誤差分布

Q-Exactive質譜儀的一級質譜和二級質譜質量精確度都小于2 ppm。但為了防止遺漏鑒定結果，因此基于數據庫搜索策略的肽段匹配誤差控制在0.02 Da以下。圖1顯示了所有匹配到的肽段的相對分子量的真實值與理論值之間的誤差分布。

3.2 蛋白質鑒定

3.2.1 基本鑒定信息 二級譜圖總數（TotalSpectra）344 342，為匹配到的譜圖數量（Spectra）82 990，為匹配到特有肽段的譜圖數量（UniqueSpectra）69 574，鑒定到特有肽段序列的數量（UniquePeptide）11 135，鑒定到的蛋白質數量（Protein）2 783。

3.2.2 差異蛋白質定量信息統計 在相對定量時，如果同一個蛋白質的量在兩個樣品間沒有顯著的變化，那么其蛋白質豐度比接近于1。當蛋白的豐度比即差異倍數達到1.2倍以上，且經統計檢驗其P<0.05時，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。差異結果表明SHR組與WKY組比較兩組共有183個蛋白達相差1.2倍以上，其中68個上調，115個下調。

3.3 差異蛋白的Pathway富集分析

3.3.1 富集Pathway 見表1。

3.3.2 富集Pathway蛋白質 見表2。

4 討論

心肌肥厚是一個因子、多途徑的作用的結果，單一蛋白的改變是可以導致心肌肥厚，但是多個蛋白失衡的交互作用，可能是關鍵性要素，為此本項目在篩選出差異蛋白后，結合蛋白的Pathway通路，從多個蛋白角度出發，試圖從整體性層面的失衡來解釋SHR左心室肥厚的機理及其藥物干預的機制。為此是以KEGG Pathway為單位，應用超幾何檢驗，找出與所有鑒定到蛋白背景相比，在差異蛋白中顯著性富集的Pathway。通過Pathway顯著性富集能確定差異蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。本項目通過Pathway富集分析篩選出：SHR與WKY比較上調的差異蛋白有：1主要組織相容性復合物、2血小板活化因子乙酰水解酶、3有絲分裂原蛋白激酶、4熱休克27 kDa蛋白、5 Ighg3、6 14-3-3γ蛋白、7纖維蛋白原、8蛋白酶體26S、9纖維蛋白原γ鏈、10中性膽固醇酯水解酶、11溶血PAF乙酰轉移酶、12纖連蛋白。下調的差異蛋白有：13絲氨酸蛋白酶、14載脂蛋白H、15血清鋅α2糖蛋白、16泛醌9、17泛醌7、18α2-AP、19激肽原、20肝素2、21未知蛋白、22鈉鉀ATP轉移酶、23膠原蛋白、24集聚蛋白、25對羥基苯丙酮酸雙氧化酶、26C反應蛋白、27整合素、28凝血因子Ⅻ、29激肽原、30整合素α7、31碳酸酐酶、32CD36、33免疫球蛋白重鏈γ多肽、34轉膠蛋白、35血紅蛋白-α。

4.1 上調蛋白質意義

主要組織相容性復合物（MHC）的功能是以其產物提呈抗原肽而激活T淋巴細胞，與T細胞表面的T細胞受體結合，實現對抗原和MHC分子的雙重識別。在缺血、缺氧、炎癥反應等刺激影響下MHC分子表達上調，可被各種炎性因子激活而發揮作用[2]。炎癥反應介導了高血壓病左心室肥厚已經是研究者的共識。

血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）具有水解血小板活化因子和相關磷脂片段并使之失活的作用。血小板活化因子（PAF）能促使血小板和中性粒細胞聚集；促使多種細胞使之產生趨化性及化學激動；參與呼吸暴發和超氧化物的形成、蛋白質的磷酸化；作用于蛋白激酶C（PKC）、花生四烯酸及磷酸肌醇的代謝；促使糖原的分解；促使腫瘤壞死因子的產生；調節白介素的分泌、TIMP-1，具有觸發和放大炎癥的作用[3]。PAF在生物體內在溶血PAF乙酰轉移酶、與PAF乙酞水解酶（LPCAT）作用下以動態形式存在，細胞受到刺激時生成，隨后很快被代謝消除。PAF的代謝失活是由PAF乙酞水解酶水解。溶血PAF乙酰轉移酶具有將PAF水解片段，合成PAF的作用[4]。我們推測這個兩個酶水平上調顯示血小板活化因子體系處于激活狀態。

絲裂原活化蛋白激酶3（MKK3）是p38 MAPK的上游激活分子，能夠特異性激活p38MAPK。p38 MAPK信號通路除了參與基因轉錄調控外，p38MAPK還參與細胞凋亡、細胞因子生成、細胞骨架重構等生物事件發揮其重要作用，被認為是細胞信息傳遞的交匯點和共同通路。在正常生理狀態下細胞的生長和增殖中有重要作用，在病理性因素刺激引起的心肌細胞肥大的信號轉導中也起到重要作用[5]。

熱休克蛋白27是小熱休克蛋白家族中最具代表性的成員，其水平的增高，是否是心肌細胞肥大時的代償作用，有學者的研究證實了這一點。在運動誘導的生理性心肌肥厚模型中，HSF1和熱休克蛋白如Hsp27和Hsp70的表達明顯上調。國內也有學者證實心臟特異性高表達Hsp27具有的誘導小鼠心肌肥厚的作用，ERKs的激活可能是其中的重要分子通路[6]。

IgG中重鏈CH3功能區，具有結合組織細胞的作用。IgG是屬于抗體，表明各種損傷因素增加，導致心肌細胞損傷。

14-3-3是一個調節蛋白家族，能與Raf-1，PKC，細胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（Cdc25C），Ras激酶抑制因子（KSR），Bcr，Ca2+/CaM激酶，Bad和跨膜蛋白受體等多種信號蛋白結合， 說明14-3-3蛋白在信號轉導過程中發揮重要作用。而以上這些蛋白在心肌肥厚的過程中發揮著重要的作用[7]。

纖維蛋白原（fibrinogen，Fg）在分子結構上包含三條多肽鏈：Aα、Bβ和γ，分別被纖維蛋白原α（FGA）、纖維蛋白原β（FGB）和纖維蛋白原γ（FGG）三種獨立基因所編碼。近來的研究表明纖維蛋白原β鏈的合成是Fg合成的限速步驟。雖在肝細胞內合成，但也可在上皮細胞和成纖維細胞等合成，并與纖維黏連蛋白、層黏連蛋白、透明質酸等協同構成細胞外基質，并通過細胞間黏附分子-1介導的P38、ERK及JNK通路導致心肌細胞異常增生[8]。心肌細胞外基質（ECM）由膠原、纖粘連蛋白、層粘連蛋白及彈性蛋白、蛋白聚糖等組成，其中主要成分是膠原。Ⅰ型膠原占膠原總量的85%，有較大的張力，伸展回彈性小，主要聚合成粗纖維網[9-10]。過量的膠原沉積在心肌間質，可使膠原網絡增粗變密，心室被動回彈性下降、心壁硬度增大，心肌順應性下降，從而導致心臟舒張功能障礙。不同原因所致的間質重構，膠原纖維的變化不同。壓力超負荷性左室肥大時，心肌間質膠原合成增加。但心肌缺血或缺血再灌注時心肌膠原纖維出現斷裂，含量減少。壓力負荷過重導致的左心室肥厚中初期質膠原合成增加，而在第4周時肌膠原纖維量減少[11]。

蛋白酶體可分為20S蛋白酶體和26S蛋白酶體兩種形式，細胞內最普遍存在的蛋白酶體是26S蛋白酶體，它是一種包含有1個20S核心顆粒和2個19S調節顆粒的桶狀結構，也是一種依賴ATP的蛋白水解復合體盡管蛋白酶體在心肌肥厚中的具體作用有待研究，但在一些心肌肥厚的模型中檢測出了蛋白酶體亞單位蛋白質表達的增強，這是因為蛋白酶體促進了心肌肥厚的抑制因子的降解，如早期誘導環腺苷酸抑制因子。此外蛋白酶體還參與了蛋白質降解、修改延長因子的活動等機制[12]。

中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs），在中性PH環境下，催化膽固醇酯（CE）水解作用的酶有多種，被稱為中性膽固醇酯水解酶。不僅可以清除已蓄積于泡沫細胞中的CE，而且能夠防止CE的積聚。nCEHs可不同程度的影響炎癥CD40-CD40L系統，從而參與炎癥反應過程，與心室重構有著密切的關系[13]。

纖連蛋白（fibronectin，Fn）作為細胞外基質（ECM）中重要的黏附分子之一，通過與細胞膜上的整合素受體（avβ3，avβ1，avβ5，α4β1，α9 β1）結合，從而刺激P38 MAPK下在促進心肌細胞黏附、遷移、增殖等過程中發揮著重要作用[14-15]。

4.2 下調蛋白質意義

血清鋅α2糖蛋白（ZAG）對目前的熱點如瘦素，脂聯素（APN）等脂肪因子有強烈的調節作用，能夠上調脂聯素的表達[16]。而APN通過抑制細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路，激活磷酸腺苷活性蛋白酶（AMPK）抑制心肌細胞的肥大[17]。

激肽原1（HKa）是激肽釋放酶-激肽系統中的成員之一，作用極其復雜。已經肯定的功效是增強機體的血管舒張能力，促進免疫炎癥反應。被證實具有抗粘附特性，HKa能夠與帶負電荷物質表面上的粘附蛋白結合并將其置換出來；HKa能競爭性抑制纖維蛋白原和體外連接蛋白（VN）等粘附蛋白與細胞表面結合；HKa能抑制細胞粘附到蛋白包被的表面上。激肽釋放酶-激肽系統（KKS）具有強大的心血管保護作用，通過抑制JNK/P38MAPK的磷酸化，抑制NF-KB-DNA結合活性后，抑制了MCP-1，VCAM-1從損傷部位的釋放，抑制心肌肥厚的形成的作用[18]。

近年來大量研究顯示，載脂蛋白H及其抗體與動脈樣硬化和體內血栓形成血壓增高有較大的相關性。有研究發現載脂蛋白H沉積在缺血性心肌病心肌中而在其他病變心肌樣本中沒有發現的沉積。推測存在心肌中的載脂蛋白H與炎癥過程有關[19]，進一步研究發現載脂蛋白H可以調節腺苷酸環化酶的活力，而腺苷酸環化酶具有心肌細胞的保護作用[20]，抑制心肌肥厚。

α2-AP中α-2 抗纖溶酶是纖維蛋白溶解酶的重要抑制因子，其表達的下調可導致活化的纖維蛋白溶解酶含量增高，而后者則會改變ECM的完整性，從而影響纖維化的發生，在一項肝纖維化的研究中發現肝纖維化組織中α2-AP 水平含量降低，而經干預后肝纖維化程度降低后，α2-AP水平上調。心室肥厚也存在心肌纖維化，α2-AP也可能呈現下調趨勢[21]。

肝素2是絲氨酸蛋白酶抑制劑超家族之一，是存在于體內外的另外一種主要的抗凝血酶物質，還參與炎癥反應過程，可以被中性粒細胞釋放的彈性蛋白酶水解，釋放出來的N端多肽片段對中性粒細胞和單核細胞具有趨化作用，在肺內的作用可能是防止肺內纖維蛋白的沉積的作用[21-22]。在心室肥厚中水平下調可能是炎癥過程中分解的結果。

凝血因子Ⅶ （FXII）是肝臟合成的一種絲氨酸蛋白酶，是凝血接觸途徑的重要組成因子，在高分子量激肽（HK）和血漿激肽釋放酶（PK）共同參與下激活內源性凝血途徑[23]。還具有促炎癥作用，主要通過誘導中性粒細胞聚集和脫顆粒，以及面通過高分子量激膚（HK）生成緩激肽，進一步增強血管壁通透性等功能。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

對羥基苯丙酮酸雙氧化酶（HPPD）是近年來在除草劑靶標探索中發現的一種靶標酶，參與植物中質體酮和生育酚的生物合成，同時也參與了大多數生物體的酪氨酸和苯丙氨酸分解代謝。HPPD在人及其它哺乳動物體內的主要作用是促進酪氨酸的代謝涉及泛醌等萜醌生物合成[24]。輔酶Q又稱泛醌，輔酶Q作為心肌線粒體內膜的一種遞氫體，參于電子傳遞過程，是細胞呼吸和代謝的激活劑。以人類輔酶Q10，節心肌細胞的代謝功能，能減輕心肌細胞因缺血或充血造成的組織損傷，從而保護心肌功能，并提供充足的ATP[25]。

鈉鉀ATP酶，或稱鈉泵、鈉鉀離子激活的腺苷-5'-三磷酸酶。Na+-K+-ATP的主要功能是將細胞內的Na+泵出和將胞外的K+泵入，平衡細胞內外Na+、K+，是生物電產生的基礎， 也是細胞膜繼發性主動轉動的能量來源；Ca2+-ATP的主要功能是將細胞內 Ca2+泵入肌漿網，它同Na+-Ca2+交換共同維持細胞內Ca2+穩態。心肌肥厚時Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性下降，導致細胞內Ca2+、Na+增多。胞內Na+增多引起Na+-Ca2+交換增加，進一步加劇細胞內Ca2+超載，從而引起心肌細胞凋亡[26]。

碳酸酐酶3（CA3）的可能生理作用主要有清除胞內CO2、調節胞內pH值、維持組織酸堿平衡、抗氧化、能量代謝和信號轉導等方面均發揮重要的作用。由于CA3具有磷酸酶活性作為一種的新的蛋白質酪氨酸磷酸酯酶（PTP），它可能參與細胞內的信號轉導。鑒于PTP可作為酪氨酸激酶的天然拮抗劑，因此CA3很可能對依賴酪氨酸磷酸化的信號轉導通路會產生負面影響。而酪氨酸激酶與MAPK級聯反應參與細胞的生長、增殖、分化，在高血壓左心室肥厚心肌中呈現高表達[27]。這種碳酸酐酶3水平的降低將導致心肌細胞肥大，而增高將有助于抑制心肌細胞的進一步肥大、增生。

Transgelin也稱轉膠蛋白，是一種肌動蛋白壓力纖維素相關的蛋白質，與凝膠劑起反應并能穩定體外的肌動蛋白凝膠劑。最本源功能是和肌動蛋白結合，從而參與細胞骨架重構和調整。可降低Rho激酶相關信號通路并增加肌動蛋白解聚，最終降低肌球蛋白輕鏈磷酸化。在心肌肥厚時Rho激酶相關信號通路被激活，Rho mRNA呈現出高表達[28]。Transgelin基因敲除小鼠研究表明該基因敲除后能改變血管平滑肌形態，增加ROS表達，激活NF-KB 等炎癥通路[29]。

有報道顯示血紅蛋白-α（Hb-α）與脂多糖的相互反應能使脂多糖的生物學活性顯著增加。此外脂多糖的致命性毒素的侵蝕性由Hb-α的出現而加強。Hb-α是通過裂解脂多糖來加強其生物學活性的。進一步的研究顯示交鏈Hb-α與酰化內毒素的相互反應有靜電性也有非靜電的疏水性，這種性質使內毒素由非惰性轉為活性形式， 不同交聯Hb-α的濃度和不同的反應溫度對Hb-α與內毒素的反應均有影響[30]。而脂多糖（LPS）廣泛存在的致熱原，是最常見誘導炎癥反應的物質之一，它能夠通過誘導NF-KB信號通路心肌細胞肥大[31]。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

CD36基因（亦成為脂肪酸轉位酶基因）編碼有助于脂肪酸吸收及組織代謝的蛋白，在多種細胞表面表達，CD36在大鼠模型中對心肌有保護性作用。研究發現，CD36缺乏大鼠的心臟質量/體重指數比正常大鼠高10%，并且CD36缺乏的大鼠心肌對缺血的耐受力下降，表明CD36與左心室肥大相關[32]。

整合素家族是一類細胞粘附受體蛋白，其不僅能夠介導細胞與胞外基質之間的粘附，還可以調節并整合胞內外信號激活相關信號通路從而影響多種細胞生物學功能。心臟中的心肌細胞和非心肌細胞都表達整合素， 研究表明， 整合素可以介導堿性成纖維生長因子（bFGF）和血管內皮生長因子（VEGF），而這兩種因子在促心肌細胞的肥大中重要的作用[33]。在心室肥厚的作用有待進一步探索。

集聚蛋白對免疫細胞、神經細胞粘附分子、細胞外基質、蛋白多糖具有聚集作用，將疏散狀態變成成簇狀態以至能緊密結合[34]。蜱抗凝血肽（TAP）是從毛白鈍緣蜱中分離的Xa因子的抑制劑。TAP是新型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由60個氨基酸組成的單鏈酸性多肽，包括6個半胱氨酸殘基，體外實驗顯示能抑制正常人血漿的凝固。在心室肥厚中的變化有待進一步探討。

多項研究證實在高血壓狀態時C反應蛋白水平增高，且具有促進心室肥厚的作用，本項目研究顯示在左室肥厚時下調，其反常變化需進一步探索。

4.3 SHR左心室肥厚的機制

血流動力學超負荷通過機械拉伸的直接作用及激活神經體液因子的間接作用引起是引起高血壓左心室肥厚的起始動因。高血壓時心肌細胞受到機械拉伸力的作用。從而導致細胞膜、以及細胞器上離子通道、跨膜蛋白的的改變引起細胞內因子及其介導的信號通路的傳導，而激活的信號途徑又會導致多種因子的活化，影響到細胞凋亡、炎性表達、細胞增殖分化，而促進心肌肥大，以代償機械拉伸力。由于增高血壓的持續性，導致細胞因子→信號途徑→細胞因子呈現出惡性循環狀態。本項目研究顯示主要涉及Ca2+介導的信號通路；有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路；蛋白激酶C（PKC）信號通路；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路；核因子-kb信號通路。

乙酰水解酶與乙酞水解酶屬血小板活化因子體系，兩者水平的上調表明血小板活化因子呈激活狀態這將介導蛋白激酶C（PKC）信號通路，另外14-3-3蛋白、纖維蛋白原、α2-AP蛋白水平上調也會激活PKC，過量表達的 PKC可顯著誘導心肌肥厚。

絲裂原活化蛋白激酶3、中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs）、纖連蛋白（Fn）過度表達可以激活P38 MAPK途徑，而激肽原1、碳酸酐酶3（CA3）的低表達可以解除對P38 MAPK途徑抑制，過量表達的P38 MAPK途徑可以促進細胞的肥大以及基質的增生。

纖維蛋白原水平上調可以激活ERK途徑，血清鋅α2糖蛋白（AG）水平下調可以解除脂聯素對ERK途徑的抑制，激活ERK途徑致使熱休克蛋白代償性增高，最終導致心室向心性肥厚。

14-3-3蛋白、纖維蛋白原水平上調可以激活Ca2+介導的信號通路，導致鈉鉀ATP水平水平降低，細胞內鈣超載，發生心肌肥厚。

血清鋅α2糖蛋白（ZAG）、載脂蛋白H水平下調導致AMPK途徑下調，而AMPK可以保護心肌缺血損傷， 限制各種因素所致的心肌肥厚。

中性膽固醇酯水解酶1（nCEHs）水平上調激活NF-kb途徑、膠轉蛋白水平下調可以解除對核因子NF-kb途徑抑制，共同導致NF-kb途徑表達上調，導致心肌肥厚。通過上述5條信號通路的協同作用，從心肌凋亡、細胞增殖增生、炎癥等不同角度導致細胞內蛋白合成增加，細胞基底膜增生導致心室肥厚的發生，其余的蛋白則從促進抑制心肌肥厚蛋白降解（蛋白酶體），調節心肌能量代謝（HPPD、輔酶Q10），缺乏心肌保護（CD36）免疫反應（Ighg3）促心肌肥厚的作用。

4.4 小結

通過前期研究[35]及對以上變化蛋白質生物機制的研判：SHR左心室肥厚發生涉及心肌凋亡、細胞增殖增生、炎癥等多種細胞因子，導致細胞損傷與保護作用失衡。

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（本文編輯 楊 瑛）