疏肝健脾解毒方對人乳腺癌細胞MCF—7增殖及凋亡的影響

李琳霈　楊曉　潘博　譚小寧　羅吉　蔣益蘭

〔摘要〕 目的 研究中藥疏肝健脾解毒方對人乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡的影響。方法 采用CCK8法檢測藥物干預(yù)12 h、24 h、48 h后對MCF-7細胞增殖的影響（分為空白對照組、陽性藥物對照組及不同濃度中藥組）；采用流式細胞術(shù)檢測藥物干預(yù)36 h及48 h后對細胞晚期凋亡率的影響（分為空白對照組、中藥組及陽性藥物對照組）。結(jié)果 中藥組吸光度低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且隨藥物濃度增高，吸光度逐漸降低；12 h至24 h，隨著作用時間延長，吸光度亦逐漸降低；24 h后較高濃度中藥組吸光度與陽性對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與空白組比較，中藥組細胞晚期凋亡率較高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但中藥組細胞凋亡率低于陽性對照組，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 疏肝健脾解毒方對人乳腺癌細胞MCF-7增殖有一定的抑制作用，可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡實現(xiàn)。

〔關(guān)鍵詞〕 疏肝健脾解毒方；人乳腺癌細胞MCF-7；細胞增殖；細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5；R273 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.008

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Shugan Jianpi Jiedu decoction on proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7. Methods The MCF-7 cells were intervened with drugs for 12 h， 24 h and 48 h （assigned into blank control group， positive drug control group and different concentrations of TCM groups）， then MCF-7 cells proliferation was detected by CCK8 method. The apoptosis rate of the cells was measured by flow cytometry after intervention with drugs for 36 h and 48 h. Results The absorbance of TCM groups was lower than that of the blank group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The absorbance decreased gradually with the increase of drug concentration， and reduced gradually with the extension of time from 12 h to 24 h， while after 24 h， the absorbance between the high concentration TCM group and the positive control group was not statistically significant （P>0.05）. The cell apoptosis rate in TCM groups was higher than that in blank group， the difference was statistically significant （P<0.01）， but was significantly lower than that in positive group （P<0.01）. Conclusion Shugan Jianpi Jiedu decoction exhibits certain inhibitory effect on human breast cancer cell MCF-7 proliferation， and its mechanism maybe through inducing cell apoptosis.

〔Keywords〕 Shugan Jianpi Jiedu decoction； human breast cancer cell line MCF-7； cell proliferation； cell apoptosis

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。自2008年以來，乳腺癌的發(fā)病率增加20%以上，死亡率增加了14%[1]。乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，在我國發(fā)達城市，特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)，已占女性惡性腫瘤發(fā)病的首位[2]，嚴重威脅著女性身體健康。“疏肝健脾解毒方”為我院治療乳腺癌的經(jīng)驗方，經(jīng)多年臨床實踐，我們運用該方治療乳腺癌患者取得良好療效。為進一步明確其作用機理，我們進行了相關(guān)實驗研究[3]，本實驗進一步探討疏肝健脾解毒方提取液對人乳腺癌細胞MCF-7的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 細胞株及藥物

人乳腺癌細胞MCF-7由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院國家重點腫瘤研究所贈送；疏肝健脾解毒方由柴胡10 g，郁金10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蒲公英30 g組成。由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供；陽性對照藥注射用鹽酸吡柔比星購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg/瓶，國藥準(zhǔn)字：H0930105，產(chǎn)品批號：1605C8。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，批號：8116293）；胎牛血清（PAN，批號：P160704）；0.25%胰蛋白酶（Gibco，批號：8252000）；CCK8（七海生物有限公司，批號20161106）；青霉素-鏈霉素混合液（Hyclone，批號：J160002）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone，批號：AB218110）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo，型號：HERAcell 2401）；超凈工作臺（法國 JouanMSC12）；高速離心機（湖南賽特湘儀，TG16-WS）；全自動酶標(biāo)儀（BioTek，型號：EIX808U）；流式細胞分析儀（美國BD，型號：BD FACSCalibur）。

2 方法

2.1 藥物制備

疏肝健脾解毒方由柴胡10 g，郁金10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蒲公英30 g組成。取以上中藥處方劑，用10倍溫水浸泡0.5 h，大火加熱煎煮，水開后繼續(xù)煎煮0.5 h，趁熱過濾。藥渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h，趁熱過濾。將3次水煎液混合、過濾，減壓濃縮為濃度為1 g/mL的溶液，在超凈工作臺內(nèi)以0.22 ？滋m微孔濾膜過濾除菌后，分裝于1.5 mL無菌EP管內(nèi)，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆名}酸吡柔比星于生物安全柜內(nèi)用注射用無菌生理鹽水配制成1 mg/mL的溶液，分裝于1 mL無菌EP管內(nèi)，置于-20 ℃冰箱備用。將中藥及陽性對照藥溶液均于臨用前加入DMEM培養(yǎng)基配成所需濃度，并檢測配制液pH值及滲透壓，確保其pH值及滲透壓均保持在正常培養(yǎng)基的可波動范圍（pH7.2～7.4、滲透壓280～320 m·sm/kg），必要時用無菌HCL和NaOH調(diào)整溶液pH值，以無菌NaCl調(diào)整溶液滲透壓。

2.2 人乳腺癌細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞MCF-7，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時予以胰蛋白酶消化、傳代，約2～3 d傳代1次。

2.3 CCK8法檢測人乳腺癌細胞MCF-7增殖情況

取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶消化后收集，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3×104/mL。從96孔板第2行第2列培養(yǎng)孔開始，每列取5孔，取8列，每1列為1組，分別設(shè)為空白對照組、中藥A組（5 mg/mL）、中藥B組（10 mg/mL）、中藥C組（15 mg/mL）、中藥D組（20 mg/mL）、中藥E組（25 mg/mL）、中藥F組（30 mg/mL）及陽性對照組（注射用鹽酸吡柔比星，參考相關(guān)文獻[4-5]及預(yù)實驗結(jié)果，濃度設(shè)為10 mg/L）。向每孔中加入100 ？滋L上述細胞懸液，4周培養(yǎng)孔均加入100 ？滋L磷酸鹽緩沖液，以防邊緣效應(yīng)。將96孔板放于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。共接種96孔板3板，分別用于給藥后12、24、48 h檢測細胞增殖情況。

24 h后取出培養(yǎng)板，吸除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，并按照分組情況向相應(yīng)列的6個培養(yǎng)孔加入含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基100 ？滋L，最下方不含細胞的培養(yǎng)孔作為該組的調(diào)零孔，以排除藥液中色素等對檢測結(jié)果的影響。

給藥后12、24、48 h分別取1塊96孔板，分別向各實驗孔加入CCK8溶液10 ？滋L，輕輕震蕩，使CCK8溶液與培養(yǎng)液混勻，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標(biāo)儀于570 nm波長下檢測各孔吸光值（OD值），計算各孔細胞生長抑制率（IR）。IR（%）=[（空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值）-（給藥組OD值-給藥組調(diào)零孔OD值）]/（空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值）×100%。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整濃度為1.5×105/mL，取6孔板2塊，每孔加入上述細胞懸液2 mL，分別設(shè)為空白組、中藥組（為保證給藥后有足夠細胞數(shù)用于流式檢測，結(jié)合增殖抑制情況，中藥濃度定為半數(shù)抑制率對應(yīng)濃度：16 mg/mL）及陽性對照組（注射用鹽酸吡柔比星，因10 mg/L時，細胞增殖抑制率過高，為保證給藥后有足夠細胞數(shù)可用于流式檢測，此處濃度設(shè)為5 mg/L），每組2孔。細胞鋪板完成后將6孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

給藥36 h及48 h后分別取出1塊6孔板，收集各實驗孔中的培養(yǎng)液于15 mL離心管中，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞后，用磷酸鹽緩沖液吹打、收集細胞，移入離心管，將各組培養(yǎng)液及細胞懸液均以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清。用4 ℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液清洗細胞沉淀2次，并合并同組培養(yǎng)液及細胞懸液離心所得細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%冰乙醇固定24 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌1次，每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，于37 ℃避光溫浴30 min。染色完成后24 h內(nèi)（期間可以置于4 ℃或冰浴避光存放）用流式細胞儀在激光波長488 nm波長處檢測熒光強度及散射情況。

重復(fù)上述步驟3次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以“x±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊時，兩組間比較用Satterthwaite近似T檢驗，多組間比較采用近似T檢驗Welch法；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用？字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞增殖的影響

疏肝健脾解毒方對MCF-7增殖具有一定的抑制作用，抑制作用具有明顯的濃度依賴性；且12 h至24 h，隨著作用時間延長，抑制作用明顯增強，但24 h至48 h，時間依賴性不明顯，提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7增殖的抑制作用在24 h左右可接近峰值（P<0.05或P<0.01）。較高濃度中藥對MCF-7增殖抑制作用與陽性對照藥（注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L）相當(dāng)（P>0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

3.2 疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞凋亡的影響

與空白組比較，中藥組（16 mg/mL）MCF-7細胞晚期凋亡率較高，且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用；但中藥組MCF-7細胞晚期凋亡率低于陽性對照組，且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7的誘導(dǎo)凋亡作用不及陽性對照藥（注射用鹽酸吡柔比星5 mg/L）；同組藥物作用后48 h與36 h比較，細胞凋亡率增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2，圖2。

4 討論

乳腺癌，中醫(yī)稱之為“乳巖”“惡瘡” “失榮”等[6]。肝主疏泄，喜條達而惡抑郁，而乳腺癌患者多為中老年女性，更年期患者多見，常為肝郁體質(zhì)[7]。眾多醫(yī)家認為，乳腺癌多由郁怒傷肝、肝郁氣滯，又因思慮傷脾、脾失健運[8]，如明代《外科正宗》中所言：“憂郁傷肝，思慮傷脾，積慮在心，所愿不得者，致經(jīng)絡(luò)痞塞，積聚成核”。故其發(fā)病的關(guān)鍵是情志不遂，肝郁脾虛。肝失疏泄貫穿于乳腺癌發(fā)生發(fā)展的全過程[9-11]。健脾疏肝法成為治療乳腺癌及其相關(guān)并發(fā)癥的重要治則[12]。我們根據(jù)多年經(jīng)驗，認為肝郁脾虛是乳腺癌發(fā)病的重要原因之一，乳腺與肝、脾、腎及沖任二脈關(guān)系密切，并將乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展歸納為“瘀、毒、虛”，即：正氣虧虛， 瘀毒互結(jié)[13]。“疏肝健脾解毒方”是我院治療乳腺癌的經(jīng)驗方，方由柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英組成。該方以柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)疏肝健脾，白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱解毒。全方藥物配伍精要，疏肝健脾、清熱解毒、扶正抗癌，標(biāo)本兼治。

本研究用CCK8法驗證了疏肝健脾解毒方提取液對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其對MCF-7細胞的增殖抑制作用較強，且藥物濃度、作用時間均與細胞增殖抑制率相關(guān)。較高濃度中藥對MCF-7細胞的增殖抑制作用與化療藥物（注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L）相當(dāng)。同時用流式細胞術(shù)檢測了疏肝健脾解毒方提取液對MCF-7細胞凋亡的影響。與空白組比較，疏肝健脾解毒方組MCF-7細胞晚期凋亡率較高，且差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用。因此疏肝健脾解毒方可能通過誘導(dǎo)細胞凋亡的方式抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖。本研究不但可佐證疏肝健脾解毒方的臨床療效確切，也為其在抗乳腺癌作用機制中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯 楊 瑛）