雙丹明目膠囊對糖尿病模型大鼠視網膜VEGF—a、VEGF—b表達的影響

彭俊　潘坤　劉崢嶸　秦裕輝　彭清華

〔摘要〕 目的 觀察雙丹明目膠囊對糖尿病模型大鼠視網膜VEGF-a、VEGF-b表達的影響。方法 將40只SD大鼠，采用隨機數字表法分為A（正常組）、B（模型組）、C（雙丹明目組）、D（陽性對照組）4組，每組10只20眼。將B、C、D三組實驗大鼠采用STZ（以50 mg/kg的劑量）一次性尾靜脈注射建立糖尿病視網膜病變模型，造模1周后開始連續灌胃用藥，灌胃后4周、8周，分別處死一半動物，采用免疫組化法檢測視網膜組織中VEGF-a、VEGF-b的表達。結果 成模后用藥第4周、8周，模型組、雙丹明目組、陽性對照組視網膜中VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均灰度值均低于正常組，平均光密度值均高于正常組，其中模型組與正常組比較，差異均具有統計學意義（P<0.01）；雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b表達的平均灰度值均高于模型組、平均光密度值均低于模型組（P<0.05或P<0.01）。結論 雙丹明目膠囊能明顯提高糖尿病模型大鼠視網膜中VEGF-a、VEGF-b表達的平均灰度值、降低其平均光密度值，表明雙丹明目膠囊能明顯降低VEGF-a、VEGF-b在視網膜中的表達。

〔關鍵詞〕 雙丹明目膠囊；糖尿病大鼠模型；VEGF-a；VEGF-b

〔中圖分類號〕R276.7；R289.5；R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.006

〔Abstract〕 Objective To observe the effect of Shuangdan Mingmu capsule on the expression of VEGF-a and VEGF-b in retina of diabetic model rats. Methods The 40 SD rats were randomly divided into group A （normal group）， group B （model group）， group C （Shuangdan Mingmu group） and group D （positive control group）， 10 rats （20 eyes） in each group. The diabetic model rats were built by one-time tail vein injection with STZ （50 mg/kg）. After modeling for one week， the rats were given medicine by gavage. After gavage for 4 weeks and 8 weeks， half animals were sacrificed. The expression of VEGF-a and VEGF-b in retina were deected by immunohistochemical method. Results After modeling for 4 weeks and 8 weeks， the average gray value of VEGF-a and VEGF-b expression in the retina of the model group， Shuangdan Mingmu group and the positive control group were lower than those of the normal group， and the average optical density of those three groups were higher than the normal group. There was a significant difference between the model group and the normal group （P<0.01）. The average gray value of VEGF-a and VEGF-b expression of Shuangdan Mingmu group and positive control group were higher than those of model group， and the average optical density value were lower than those of model group （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Shuangdan Mingmu capsule ccould significantly increase the average gray level of VEGF-a and VEGF-b in diabetic retina and decrease its average optical density. It indicates that Shuangdan Mingmu capsule could significantly reduce the expression of VEGF-a and VEGF-b in the retina.

〔Keywords〕 Shuangdan Mingmu Capsule； diabetic rat model； VEGF-a； VEGF-b

糖尿病性視網膜病變（diabetic retionopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）中最常見和嚴重的微血管并發癥，是導致DM患者視力下降的主要原因，若不及時治療，可造成不可逆的視功能損害。秦裕輝教授認為，糖尿病視網膜病變的主要病機為肝腎虧虛、脈絡瘀阻，并在長期臨床實踐的基礎上，創制了國內第一個專治糖尿病視網膜病變的中藥新藥——雙丹明目膠囊。前期研究表明，雙丹明目膠囊的作用機理可能與降低DR大鼠血糖和糖化血紅蛋白含量、改善大鼠視網膜和胰腺組織結構、降低血小板黏附率、改善血液流變性、促進血液循環作用等有關[1-4]。本實驗進一步觀察了雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠視網膜VEGF-a、VEGF-b表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 取健康，無眼部疾患，一月齡SD大鼠40只，體質量200～250 g，SPF級，遠交系，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK（湘）2009-0001，質量合格證號：11400700027462。實驗前檢查雙眼眼部情況無異常，排除全身病變。動物置于18～20 ℃，相對濕度60%～70%，通風干燥的SPF動物實驗室，予以經嚴格消毒的實驗鼠顆粒飼料及Ⅲ級清潔飲用水飼養，每隔2 d清洗消毒籠具、飲水器具。

1.1.2 實驗藥品 雙丹明目膠囊：由女貞子、旱蓮草、山茱萸、淮山、茯苓、澤瀉、牡丹皮、丹參、三七、菝葜、牛膝等藥物組成，由湖南省中醫藥研究院中藥研究所提供。羥苯磺酸鈣：寧夏康亞藥業有限公司，250 mg/粒，批號：1131115。重組人血管內皮抑制素注射液：山東先聲麥得津生物工程股份有限公司，15 mg/支，批號：201507018。

1.1.3 實驗試劑 VEGF-a、VEGF-b（武漢博士德生物技術有限公司）；尿糖試紙（海爾斯醫療器械公司）；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（Sigma公司）；戊巴比妥鈉（上海化學試劑分裝廠）；蘇木精-伊紅（北京鼎國生物公司）；4%多聚甲醛、l%餓酸、丙酮、Epon 812環氧樹脂、醋酸鈾、檸檬酸鉛、醋酸異戊脂（長沙福滋堂生物技術開發有限公司）；Harris蘇木素、伊紅、3%過氧乙酸（北京中杉金橋生物技術公司）。

1.1.4 實驗器材 JY3002型電子天平：上海精密科學儀器有限公司；LEICA DM LB2型顯微照相系統：德國LEICA公司；Shandon 325型石蠟切片機：英國Shandon公司；Motic B5顯微攝像系統：麥克奧迪實業集團公司；LEICA顯微鏡：德國LEICA公司；JSM-1 200透射電鏡：日本JEOL公司；雙目顯微鏡：德國Motic公司；RM2235輪轉石蠟切片機：德國徠卡公司；Motic 6.0數碼醫學圖像分析系統：深圳市深沅恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組 動物常規飼養1周后，采用隨機數字表法將40只大鼠分為A、B、C、D 4組，每組10只大鼠20只眼。分別為A組：正常組；B組：模型組；C組：雙丹明目組；D組：陽性對照組。

1.2.2 造模 對除A組外的30只大鼠進行造模：造模前大鼠禁食10 h，自由飲水；將STZ以50 mg/kg的劑量對大鼠進行一次性尾靜脈注射。A組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，強生血糖測試儀測血糖；尿糖試紙定性測尿糖。空腹血糖濃度>16.7 mmol/L、尿糖在+++以上者，即為糖尿病模型大鼠。成模后觀察1周，血尿糖高且穩定者為造模成功，然后開始計算病程。造模后無大鼠死亡，2只大鼠血糖值偏低，進行第2次尾靜脈注射后達標。

1.2.3 給藥方法 各組動物自飼養1周后開始連續灌胃4周，每天一次。后處死一半動物（每組各5只大鼠），其余動物繼續灌胃4周，共8周，再處死。各組大鼠均不限飲食，每日更換墊料1次，按時通風，保持環境安靜。（1）正常組（A組）、模型組（B組）：A、B組以生理鹽水10 mL/kg灌胃。（2）雙丹明目膠囊組（C組）：使用雙丹明目膠囊溶液灌胃，劑量12.5 mL/Kg。（3）陽性對照組（D組）：參考國外相關文獻報道[5]，采用羥苯磺酸鈣溶液灌胃+重組人血管內皮抑制素玻璃體內注射，羥苯磺酸鈣溶液：1次/d；重組人血管內皮抑制素：造模后第10天開始玻璃體注射，注射前先前房穿刺放出少量房水約20 μL，用30 G針頭的微量注射器從顳上象限角膜緣后0.5 mm鞏膜刺入玻璃體，玻璃體內注射重組人血管內皮抑制素20 μL（5 g/L），每10天一次，共5次[6]。

1.2.4 取材 2%戊巴比妥鈉過量麻醉后斷頭法處死動物，即刻摘除眼球以10%的福爾馬林固定24 h，去除眼前節，分離出視網膜組織，流水沖洗8 h，經梯度酒精脫水后，行浸蠟、包埋、切片（厚度4 μm）。

1.3 指標檢測

1.3.1 免疫組化法檢測視網膜VEGF-a蛋白的表達 采用SP法：高倍鏡下觀察VEGF-a蛋白的表達情況，判斷標準：免疫組化反應后陽性標記的細胞胞漿著色呈棕色或深棕色。高倍鏡下隨機選取10個視網膜視野，用圖像分析系統進行圖像分析處理。

1.3.2 免疫組化法檢測視網膜VEGF-b蛋白的表達 采用SP法：同“1.3.1”。

1.4 統計學處理

采用SPSS 19.0系統軟件進行實驗數據分析，計量資料以“x±s”表示，組間比較符合正態分布采用t檢驗，不符合正態分布采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-a蛋白表達情況

成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-a蛋白表達平均灰度值比較，結果：B、C、D組VEGF-a蛋白表達平均灰度值均低于A組，其中：B組與A組比較，差異具有統計學意義（P<0.01）；C、D組VEGF-a蛋白表達平均灰度值均高于B組，差異均具有統計學意義（P<0.05）；而D組與C組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，B組、C組、D組VEGF-a蛋白表達平均灰度值均有上升，但差異無統計學意義（P>0.05）。

成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-a蛋白表達平均光密度值比較，結果：B、C、D組VEGF-a蛋白表達平均光密度均高于A組，其中：B組與A組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），結果顯示B組VEGF-a在視網膜中廣泛表達；C、D組VEGF-a蛋白表達平均光密度值均低于B組，差異均具有統計學意義（P<0.01），說明經雙丹明目膠囊、陽性對照藥物處理后，大鼠視網膜上VEGF-a的表達有明顯的下調；而D組與C組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，B組、C組、D組VEGF-a蛋白表達平均光密度值均有下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

圖片描述，A組：正常視網膜中，在神經纖維層、神經節細胞層及內叢狀層有少量VEGF-a蛋白陽性表達。B組：視網膜上VEGF-a蛋白陽性表達明顯增多，并逐漸向外叢狀層遷移。C組：視網膜上VEGF-a蛋白陽性表達略有增多，但較B組少。D組：視網膜上VEGF-a蛋白陽性表達略有增多，但較B組少。見圖1-2。

2.2 成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-b蛋白表達情況

成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-b蛋白表達平均灰度值比較，結果：B組、C組、D組VEGF-b蛋白表達平均灰度值均低于A組，其中：B與A組比較，差異具有統計學意義（P<0.01）；C組、D組VEGF-b蛋白表達平均灰度值均高于B組，差異均具有統計學意義（P<0.01）；而D組與C比較，差異無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，B組、C組、D組VEGF-b蛋白表達平均灰度值均有上升，但差異無統計學意義（P>0.05）。

成模后用藥第4周、第8周糖尿病大鼠視網膜VEGF-b蛋白表達平均光密度值比較，結果：B、C、D組VEGF-b蛋白表達平均光密度均高于A組，其中：B組與A組比較，差異具有統計學意義（P<0.01），結果顯示B組VEGF-b在視網膜中廣泛表達；C、D組VEGF-b蛋白表達平均光密度值均低于B組，差異均具有統計學意義（P<0.01），說明經雙丹明目膠囊、陽性對照藥物處理后，大鼠視網膜上VEGF-b的表達有明顯的下調；而D組與C組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，B組、C組、D組VEGF-b蛋白表達平均光密度值均有下降，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

圖片描述，A組：正常視網膜中，在神經纖維層、神經節細胞層及內叢狀層有少量VEGF-b蛋白陽性表達。B組：視網膜上VEGF-b蛋白陽性表達明顯增多，并逐漸向外叢狀層遷移。C組：視網膜上VEGF-b蛋白陽性表達略有增多，但較B組少。D組：視網膜上VEGF-b蛋白陽性表達略有增多，但較B組少。見圖3-4。

3 討論

3.1 中醫學對糖尿病視網膜病變的認識

中醫學稱糖尿病視網膜病變為“消渴內障”[7]，根據患眼視覺變化及視力下降情況，將其納入不同的病癥中，如“視瞻昏渺”“云霧移睛”“血灌瞳神”“暴盲”等[8]。對于本病的認識，金代醫家張子和在《儒門事親》中指出：“消渴者，耗亂精神，過為其度，而燥熱郁盛所成也……可變為雀目或內障”，認為燥熱傷陰為其主要病機；明代趙獻可認為“治消之法無分上中下，先治腎為急，惟六味八味及加減八味丸隨證而服，降其心火滋其腎水則渴自止也”。明代王肯堂所著《證治準繩》亦云：“三消之久，精氣虧虛，則目無所見”，認為本病為精血虧虛、目失所養而成。其后歷代醫家多在此基礎上加以研討發揮，多數認為消渴病日久，精虧液少，不能上承目絡，目睛失養；或肝腎陰虛日甚，陰虛陽亢，虛火上炎，灼傷目絡，而致視物模糊，甚至失明。現代醫家借助眼底檢查、熒光造影等手段，并從血流變、微循環、血生化等方面對本病進行研究，發現“血瘀”在其發病機理中具有重要作用，因此，秦裕輝教授認為本病病因病機為：腎虛是根、陰虛為本、血瘀為標，“腎虛血瘀”為其主要病機，故治療DR應該以“滋腎活血”為基本法則。

基于這一法則，秦裕輝教授創制了雙丹明目膠囊（原名降糖明目膠囊），開發出國內第一個專治糖尿病視網膜病變的中藥新藥，該藥具有益腎養肝、活血明目之功，主治肝腎陰虛、瘀血阻絡所致的糖尿病視網膜病變。多中心臨床試驗取得較好的療效[9-11]，證實該藥能改善患者眼底病變，促進視力恢復，起到治療糖尿病視網膜病變的作用。團隊的前期藥理研究[1-4]也發現，雙丹明目膠囊聯合降糖藥物能大幅度的促進其降糖效果，單用也能降低血小板黏附率，改善血液流變性，促進血液循環作用。

3.2 雙丹明目膠囊對糖尿病大鼠作用機理的探討

新生血管（neovascular，NV）是DR從非增殖型糖尿病性視網膜病變轉變為增殖型糖尿病性視網膜病變的標志性病理改變。NV的形成，受多種生長因子的調節，其中，VEGF是血管新生過程中的關鍵因子。VEGF是一個家族，包括VEGF-a、VEGF-b、VEGF-c、VEGF-d、VEGF-e以及胎盤生長因子等[12]。VEGF-a是一種高度保守的、由二硫鍵相連的同源二聚體糖蛋白，還原條件下同源二聚體分開成為單體，并喪失所有的生物學活性。VEGF-a能促進血管內皮細胞增殖，VEGF作為特異性的血管內皮細胞分裂素，能夠刺激體外培養的血管內皮細胞發生有絲分裂和遷移；而作用于體內血管內皮細胞，可引起內皮細胞分裂增殖，誘導血管形成，是目前已知的作用最強的促血管生成因子。VEGF可以增加血管的通透性，尤其是微小血管的通透性，引起血漿蛋白滲漏到細胞外基質，在細胞外基質中沉著，為成纖維細胞和血管內皮細胞的遷入提供條件基質，為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網的建立提供營養[13-14]。VEGF-b主要分布于大鼠的心臟、骨骼肌、腦、腎臟和人的心臟、骨骼肌、胰腺、前列腺，研究表明VEGF-b具有促內皮細胞增生的作用[15]。VEGF-b與腫瘤的生長也有密切的關系，VEGF-b與VEGF-c可在局部促進血管生長，從而有利于腫瘤的生長[16]。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，觀察雙丹明目膠囊對糖尿病模型大鼠視網膜VEGF家族中VEGF-a、VEGF-b表達的影響，發現成模后用藥第4周、8周，視網膜中VEGF-a、VEGF-b表達平均灰度值比較：模型組、雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均灰度值均低于正常組，其中模型組與正常組比較，差異均具有統計學意義（P<0.01）；雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b表達的平均灰度值均高于模型組，差異均具有統計學意義（P<0.05或P<0.01）；而陽性對照組與雙丹明目組比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，模型組、雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均灰度值均有上升，但差異均無統計學意義（P>0.05）。該研究表明：雙丹明目膠囊能明顯提高糖尿病大鼠視網膜中VEGF-a、VEGF-b表達的平均灰度值。

成模后用藥第4周、8周，視網膜中VEGF-a、VEGF-b表達平均光密度值比較：模型組、雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均光密度均高于正常組，其中模型組與正常組比較，差異均具有統計學意義（P<0.01）；雙丹明目組、陽性對照組VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均光密度值均低于模型組，差異均具有統計學意義（P<0.05或P<0.01），說明經雙丹明目膠囊、陽性對照藥物處理后，大鼠視網膜上VEGF-a、VEGF-b的表達有明顯的下調；而陽性對照組與雙丹明目組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。成模后用藥第8周與第4周比較，模型組、雙丹明目組、陽性對照組視網膜中VEGF-a、VEGF-b蛋白表達平均光密度值均有下降，但差異均無統計學意義（P>0.05）。該研究表明：雙丹明目膠囊能明顯降低糖尿病大鼠視網膜中VEGF-a、VEGF-b表達的平均光密度值。

綜上所述，雙丹明目膠囊能明顯降低VEGF-a、VEGF-b在視網膜中的表達，對糖尿病模型大鼠視網膜毛細血管有一定的保護作用。

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（本文編輯 李 杰）