健脾軟肝方對四氯化碳致肝纖維化大鼠α—SMA及其mRNA表達的影響

陳文玲 王憲東 陳文慧 朱曉松 姚政 石安華

摘要 目的：明確健脾軟肝方對肝纖維化大鼠α-SMA及其mRNA表達的影響，初步探討健脾軟肝方防治肝纖維化的作用機制，為肝纖維化的中醫臨床治療提供實驗依據。方法：選取Wistar雄性大鼠72只，隨機分為正常組、模型組、扶正化瘀膠囊組、健脾軟肝方高、中、低劑量組。模型組利用CCl4對大鼠進行腹腔注射，按0.2 mL/100 g腹腔注射30% CCl4與70%橄欖油混合溶液，正常組注射等量生理鹽水，2次/周，4周后復制大鼠肝纖維化動物模型，該實驗采用免疫組化ABC法檢測肝纖維化大鼠α-SMA蛋白的表達水平，采用Real-time PCR法檢測肝纖維化大鼠α-SMA mRNA的表達水平，采用H-E染色和Mallory染色觀察大鼠肝纖維化的病變程度。結果：模型組α-SMA蛋白表達顯著上升（P<0.05）；健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），其中高、中、低劑量組之間α-SMA蛋白陽性表達逐漸升高，可以呈一定的藥物依賴關系。模型組α-SMA mRNA表達顯著上升（P<0.05）；健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），且高、中、低劑量組之間α-SMA mRNA表達水平逐漸升高，呈一定的藥物依賴關系。結論：健脾軟肝方抗肝纖維化的作用機制可能與抑制大鼠肝臟內α-SMA及其mRNA的表達有關。

關鍵詞 健脾軟肝方；肝纖維化；α-平滑肌肌動蛋白；大鼠；四氯化碳

Abstract Objective：To study the effects of Jianpi Ruangan Formula on the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） and m-RNA in rats with hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride （CCl4），to preliminarily discuss the mechanism of Jianpi Ruangan Formula in preventing and treating liver fibrosis，and to provide experimental basis for clinic treatment of hepatic fibrosis in traditional Chinese medicine.Methods：A total of 72 Wistar male rats were selected and randomly divided into normal group，model group，Fuzheng Huayu Capsule group，Jianpi Ruangan Formula high，middle，low dose group.Rats in model group was intraperitoneally injected with the mixed solution of 30% CCl4 and 70% olive oil at 0.2 mL/100 g while the normal group was intraperitoneally injected with the same dose of saline.Each group injected twice a week for 4 weeks，and the animal models of rat liver fibrosis was replicated after 4 weeks.The expression of α-SMA in rats with hepatic fibrosis was detected by ABC immunohistochemical method and expression of the m-RNA was determined by Real-time PCR method.The HE staining and Mallory staining were applied to observe the pathological changes of hepatic fibrosis in rats.Results：The expression of α-SMA protein in model group increased （P<0.05）.Compared with the Jianpi Ruangan formula high，middle，low doze groups，the difference was statistically significant （P<0.05）.Among them，the positive expression of α-SMA protein in the high，middle and low dose groups gradually increased，showing some signs of drug dependence.Compared with the Jianpi Ruanfang formula high，middle，low doze groups，the expression of α-SMA mRNA in model group significantly increased （P<0.05），and there was significant difference （P<0.05）.The expression of α-SMA mRNA in the high，middle and low dose groups gradually increased，showing some signs of drug dependence.Conclusion：The mechanism of the Jianpi Ruangan Formula against hepatic fibrosis may be related to the inhibition of the expression of α-SMA and m-RNA in rat liver.

Key Words Jianpi Ruangan Formula； Hepatic fibrosis； α-smooth muscle actin

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.09.041

肝纖維化（Hepatic Fibrosis）是指肝臟內彌漫性細胞外基質過度增生堆積的病理階段，是肝臟在多種病因的作用下，肝細胞損傷后自我修復的病理反應。誘發肝纖維化的病因多種多樣，其中病毒性肝炎為主要病因[1]。肝纖維化早期癥狀不明顯，患者常無明顯表象，如不及時治療，發展到后期極容易發展成為肝硬化[2]。慢性肝病現已成為威脅全球的人類身體健康的主要誘因，且在肝硬化失代償期難以治療，病死率極高，所以早期治療及預防肝纖維化的發生極為關鍵。α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth Muscle Actin，α-SMA）是肝星狀細胞（HSC）活化的標志，活化的HCS胞體展開，突出延長，增殖活躍，胞質內脂滴消失，表達α-SMA，產生ECM的能力增強，表明已轉變為肌成纖維細胞（Myofibroblast，MFB），除了增加基質成分的合成之外，還能調節ECM的降解，在肝纖維化的進程中起核胞。我們在前期研究中發現，健脾軟肝方可以有效的治療二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠，健脾軟肝方抑制ColⅠ、ColⅢ膠原的合成，促使其降解，并在抑制HSC活化等方心作用。肝臟中僅有大血管壁平滑肌細胞存在α-SMA表達，其余肝臟細胞內都無α-SMA表達；若肝臟細胞中出現大量α-SMA細胞表達，說明肝星狀細胞已經轉化為肌成纖維細面較優[3]，但是否與α-SMA蛋白及其mRNA的表達有關還不清除，本實驗以肝纖維化為研究對象，通過檢測肝纖維化大鼠α-SMA蛋白及其mRNA表達的影響，探討健脾軟肝方抗肝纖維化的機制是否與肝纖維化形成和發展有關。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本實驗選用健康雄性大鼠60只，體重（150±10） g，由四川達碩生物科技有限公司提供，動物質量合格證書編號：0017752。所有大鼠自由飲水、攝食，云南中醫學院實驗動物房中分籠飼養，環境溫度20～22 ℃，相對濕度50%～55%，通風良好。

1.1.2 藥物 健脾軟肝方由蘭花參、白芍、莪術、香附、三七等中藥組成，生藥購自云南中醫學院校醫院門診部藥方，扶正化瘀膠囊購自于云南省中醫醫院門診部藥方，生產廠家為上海黃海制藥有限責任公司，生產批號：140309。

1.1.3 試劑與儀器 1）主要試劑：鼠抗α-SMA單克隆抗體，由博士德生物有限公司提供，大鼠α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）ELISA檢測試劑盒及DAB免疫組化顯色試劑盒由生工生物工程（上海）有限公司提供。2）主要儀器：DGX-9140電熱恒溫干燥箱（太倉市華利達實驗設備有限公司），熒光顯微鏡、Image-pro Plus5.0圖像分析系統（日本Olympus株式會社），SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠），HC-2518R高速冷凍離心機（安徽中科中佳儀器有限公司），TU-1901紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限公司），PCR反應擴增儀、移液器（加拿大BIO公司），StepOne型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統中國公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物的分組與模型制備 實驗所用動物隨機分為6組，即正常組，模型組，扶正化瘀膠囊組，健脾軟肝方低劑量組，健脾軟肝方中劑量組，健脾軟肝方高劑量組，10只/組。肝纖維化動物模型的建立成功與否，是研究肝纖維化發生發展的前提。本實驗從第1周起，2次/周對大鼠進行腹腔注射，共注射四周，劑量為0.2 mL/100 g。其中模型組、扶正化瘀膠囊組、健脾軟肝方低劑量組、健脾軟肝方中劑量組、健脾軟肝方高劑量組分別腹腔注射70%橄欖油與30% CCl4混合溶液，正常組腹腔注射等量的生理鹽水。各組大鼠均給予普通飼料飼養，自由飲水。

1.2.2 動物給藥劑量及方法 健脾軟肝方按等效劑量換算法，成人每日用量為60 g，每200 g大鼠1 d所需生藥量（g）=60 g×0.018=1.08，為0.54 g/100 g·d。扶正化瘀膠囊組規格為0.3 g/粒，成人每日每次用量為：3次/d，5粒/次。據人和大鼠間體表面及折算的等效劑量比值表計算臨床等效劑量，從第一周開始給予空白組和模型組等量的生理鹽水灌胃，健脾軟肝方高、中、低劑量組每天給予相應劑量灌胃（分別是1.08 g/100 g·d、0.54 g/100 g·d、0.27 g/100 g·d），扶正化瘀膠囊組給予灌胃0.0405 g/100 g·d。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 病理組織學檢查 病理組織學采用H-E及Mallory染色2種染色方法，染色后通過光學顯微鏡觀察并記錄切片中大鼠肝組織的病變程度。在第4周末，各組大鼠禁食12 h，飲水正常。第2天以10%的水合氯醛配90%生理鹽水，按照每0.25 mL/100 g的劑量計算，對大鼠腹腔注射麻醉，迅速取出大鼠肝臟，分切成1 cm×1 cm×3 cm，置于福爾馬林溶液保存備用，并分別進行脫水、包埋、脫蠟、染色、封片，進行H-E及Mallory染色觀察。

1.2.3.2 肝纖維化分級 肝纖維化的分級標準是根據觀察匯管區周圍肝細胞炎性反應程度、小葉內情況及纖維增生程度，將肝纖維化分為4級，具體分級標準參考中華醫學會2002年肝病學肝纖維化診斷及療效評估共識[4]。見表1。

1.2.3.3 免疫組化ABC法檢測大鼠肝組織中α-SMA的蛋白表達 將標本放置于4%多聚甲醛常規灌注固定，取材后放置于20%蔗糖溶液12 h，制作蠟塊，制作切片，并貼片，PBS清洗。之后將切片分別放置于0.3%的過氧化氫甲醇溶液30 min、0.3% Triton X100 30 min、血清稀釋液稀釋的一抗在4 ℃冰箱中放置24～48 h、于PBS稀釋的的二抗中室溫孵育2 h、ABC復合物之類的抗體室溫孵育2 h，最后將切片放置于顯色液中，進行染色，時間控制在30 min左右，在這期間需要經常在顯微鏡下進行觀察，若細胞著色且背底顏色較淡時，應迅速清除顯色液，α-SMA蛋白陽性表達在切片上呈棕黃色，利用Image-pro Plus 6.0軟件分對切片進行定量分析，每張切片在光學顯微鏡下去5個視野（×40），測定α-SMA蛋白陽性表達的灰度值與總視野面積比值。

1.2.3.4 采用Real-time PCR法檢測cDNA樣本中α-SMA基因相對含量 大鼠肝組織α-SMA的表達采用Real-time PCR法。將大鼠肝臟組織均質化、勻漿并離心，提取上清液，之后相分離上清液，抽取肝組織水相中的總RNA，按試劑盒說明操作，然后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物序列：α-SMA上游引物5′-CGGGAGAAAATGACCCAGAT-3′，下游引物5′-CCAGAGTCCAGCACAATACCA-3′；內參β-actin上游引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，下游引物5′-AGCCACCAATCCACACAGAG-3′；在PCR管中加入total RNA，Random Primer p（dN）6，之后冰浴，離心加入下列試劑，37 ℃溫浴5 min、42 ℃溫浴60 min、70 ℃溫浴10 min。終止反應，最后將上述溶液-20 ℃保存。完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行反應。收集數據，采用2-△△Ct法，通過Ct值對樣本基因表達量的進行計算。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行分析，計數資料用均數±標準差（±s）表示，各組實驗結果的統計數據符合正態分布，使用單因素方差分析，不符合正態分布的數據使用秩和檢驗。2個數據之間比較時，若方差齊則使用LSD方法檢驗，若方差不齊時使用Dunnett T3檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠大體形態和大鼠肝臟觀察 實驗從第一周便開始造模，正常組大鼠飲食飲水正常，毛色光澤，大小便正常，身體狀態良好。模型組大鼠進食及進水量均減少，毛色暗黃無光澤，大便時而稀溏不成形，小便色黃，精神萎靡，注射部位無紅腫感染，肛門區紅腫。健脾軟肝方高、中、低劑量組大鼠與模型組比較活動度較好，進食進水量較模型組比較有所增加，毛色較光澤，大便時而有稀溏但總體狀況較好，腹腔注射部位無感染。正常組大鼠肝臟呈褐色，體積適中，表面光滑，質地柔軟，邊緣呈銳圓狀，無結締組織粘連，無包塊。模型組大鼠肝臟較正常組顏色淺，呈暗紅色，肝臟體積大于正常組，表面有結節，質地較硬，邊緣呈鈍圓莊且有結締組織粘連。扶正化瘀膠囊組及健脾軟肝方高、中、低劑量組大鼠肝臟顏色較模型組色澤變深，表面較光滑，肝臟大小與正常組比較稍微增大，表面有輕微結節，質地硬，但總體狀況好于模型組。

2.2 大鼠肝臟病理組織學觀察 H-E染色，光學顯微鏡下提示，正常組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞呈現卵圓狀，并以中央靜脈為圓心，肝細胞呈放射狀排列，細胞核呈圓形，肝索排列規則。模型組大鼠肝細胞腫脹變形，假小葉形成，肝索排列紊亂，局部肝細胞發生脂肪變性，膠原纖維組織擴大。此種現象說明CCl4誘導的肝纖維化大鼠造模已經成功。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組病變程度與模型組比較，病變程度較輕，肝索排列紊亂，有假小葉形成，脂肪病變程度較輕，有少許脂肪樣空泡形成，且膠原纖維減少，但光鏡下并不能明顯判斷各組間差別。

Mallory染色時，切片上膠原纖維會表現為藍色絲帶狀組織。光學顯微鏡下，正常組大鼠肝小葉結構正常，肝細胞呈卵圓狀，肝細胞呈放射狀排列，細胞核圓形，肝索排列規則。模型組大鼠肝細胞變性，假小葉形成，大量脂肪空泡出現，纖維結締組織大量沉積，肝小葉和匯管區機構被破壞。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組有假小葉形成，各組匯管區有少量纖維結締組織沉積，并少量脂肪空泡聚集，肝小葉的結構有一定程度的破壞，但總體破壞程度較與模型組比較好。

2.3 肝纖維化的分級程度 Mallory染色完成后，觀察切片后發現，模型組大鼠肝組織中，假小葉形成較多，大部分處于S3型這一階段這也從側面提示動物模型復制成功。健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織中有少量膠原纖維形成，但大部分處于S2階段，說明治療后有一定效果，各組大鼠肝纖維化程度有所減輕。

2.4 各組大鼠肝組織α-SMA蛋白的表達的觀察

肝組織α-SMA蛋白的表達，正常組大鼠肝組織中僅在血管壁周圍見少量α-SMA表達，模型組大鼠肝組織中見大量α-SMA表達，主要集中在匯管區、中央靜脈、假小葉纖維膈及臨近的肝竇區周圍。正常組與模型組比較，模型組顯著上升（P<0.05）；扶正化瘀膠囊組與模型組比較有顯著性差異（P<0.05）；健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），健脾軟肝方高、中、低劑量組之間α-SMA蛋白在肝組織中陽性表達逐漸升高，可以呈一定的藥物依賴關系。

2.5 各組大鼠肝組織α-SMA mRNA的表達 肝組織α-SMA mRNA的表達：正常組與模型組比較，模型組顯著上升（P<0.05）；扶正化瘀膠囊組為與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；健脾軟肝方高、中、低劑量組組與模型組比較，差異有統計學意義（P<0.05），高、中、低劑量組之間α-SMA mRNA表達水平逐漸升高，呈一定的藥物依賴關系。

3 討論

肝纖維化是一種慢性肝損傷導致的肝臟病理改變，HSC的活化是肝纖維化發生的中心環節[5]。HSC在肝臟中稱之為儲脂細胞，屬于肝臟間質細胞，正常情況下HSC呈卵圓狀，位于肝索與肝竇壁之間，可以貯藏脂肪與維生素A，合成少量金屬蛋白酶抑制劑等，當各種致病因素持續作用于肝臟時，通過復雜的機制激活HSC。HSC被激活后，轉化為肌成纖維細胞，然后其在肝臟內合成膠原纖維、蛋白多糖及糖蛋白等，從而形成了ECM并大量堆積于肝臟中，最終導致肝纖維化的發生[6]。平滑肌肌動蛋白共分為γ亞型、α、β 3型，其中α-SMA所占比例最高，α-SMA存在于脊椎類動物細胞中，其在細胞內有豐富的能聚合成微絲，微絲可以撐起細胞的骨架，加強細胞的能動性，并可以促進細胞的收縮及形成[7]。在生理條件下，α-SMA主要由平滑肌細胞和肌成纖維細胞表達，其表達很少，僅存在于血管壁上。當HSC被激活后，α-SMA表達大量增加，并附著于假小葉增生的纖維膈內。在各種急慢性肝病及相應的動物模型中，大鼠HSC在活化過程中喪失Desmin，轉而表達α-SMA[8]。α-SMA是HSC活化的特有標志物，α-SMA的表達與HSC的活化、增殖、復制呈正相關[9]。劉成[10]教授觀察肝纖維化形成過程中α-SMA與門脈壓力變化之間的關系，研究發現隨著肝纖維化程度的加重，α-SMA的表達也逐漸增加，二者呈正相關，且隨著α-SMA病變面積的擴大，門脈壓力也隨之增加，二者也呈正相關。

α-SMA作為肝細胞內肌動蛋白之一，對肝纖維化的發生發展起重要作用，是肝星狀細胞活化的重要標志。謝君等[11]觀察肝蘇顆粒對CCl4致肝纖維化大鼠肝功能和病理損傷的影響，免疫組化結果發現肝蘇顆粒可以降低α-SMA蛋白的表達，改善肝功能，減輕肝纖維化的病變程度。邵佳亮等[12]觀察羥基喜樹堿對CCl4誘導的肝纖維化大鼠模型具有防治作用，結果發現羥基喜樹堿可以抑制肝星狀細胞的增殖，減少α-SMA蛋白的表達。本次實驗，我們采用免疫組化ABC法檢測大鼠肝組織中α-SMA蛋白的表達，通過結果，我們觀察發現，正常組大鼠肝組織中僅在血管壁周圍見少量α-SMA蛋白表達，模型組大鼠肝組織中見大量α-SMA蛋白表達，主要集中在匯管區、中央靜脈及臨近的肝竇區周圍。扶正化瘀膠囊組，健脾軟肝方高、中、低劑量組在匯管區也可見α-SMA蛋白的表達，但其病變程度比較模型組有所減輕，說明健脾軟肝方可以減少α-SMA蛋白的表達。馬力等[13]觀察瘧母丸對進展期大鼠肝纖維化的干預作用，研究發現瘧母丸可以顯著的降低α-SMA mRNA的表達，抑制肝纖維化的進展，且這一機制與抑制HSC的活化有關。吳芙蓉等[14]觀察橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠α-SMA表達的影響，實驗結果發現橙皮苷可以顯著的降低大鼠肝組織中α-SMA及其mRNA的表達，提示橙皮苷對化學性肝纖維化大鼠具有很好的保護作用，其機制與抑制肝星狀細胞的增殖、活化有關。本次實驗，我們采用Real-time PCR法檢測大鼠肝組織中α-SMA mRNA的表達，通過結果，我們觀察發現，正常組大鼠肝組織中僅少量表達α-SMA mRNA，正常組與模型組比較，模型組大鼠肝組織中α-SMA mRNA表達顯著上升（P<0.05）；扶正化瘀膠囊組與模型組比較，肝組織中α-SMA mRNA表達顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05）；健脾軟肝方高、中、低劑量組肝組織中α-SMA mRNA表達也顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05），高、中、低劑量組之間α-SMA mRNA表達水平逐漸升高，呈一定的藥物依賴關系。由此可見，我們的結果與眾多專家的研究結論相一致，說明健脾軟肝方可以減少α-SMA mRNA的表達，其機制可能與抑制HSC的活化有關，從而起到治療肝纖維化的作用。此外，大鼠肝臟病理組織學Mallory染色結果也顯示，健脾軟肝方高、中、低劑量組及扶正化瘀膠囊組大鼠肝組織匯管區有少量纖維結締組織沉積，并少量脂肪空泡聚集，肝小葉的結構有一定程度的破壞，但總體破壞程度較模型組比較好，這進一步說明了健脾軟肝方可以改善大鼠肝纖維化的病變程度。

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（2017-12-12收稿 責任編輯：王明）