基于iTRAQ技術的慢性心力衰竭氣虛血瘀證及氣陰兩虛證組差異蛋白質組學研究

孟永梅 王 偉

(1 內蒙古醫科大學，呼和浩特，010110； 2 北京中醫藥大學，北京，100029)

慢性心力衰竭(CHF)是大多數心血管疾病的最終歸宿，也是最為主要的死亡原因之一。CHF是目前唯一發病率仍在顯著上升的心血管疾病,且醫療費用比較高[1]。最新研究結果表明衰弱的心肌從代償期轉變為失代償期發生的細胞改變中，發現RBFox2減少與心肌衰弱之間的功能聯系[2]。在人群中心力衰竭的發病率為1.5% ～5.6%，65歲以上者達到7.4%，2年死亡率為37%，6年死亡率為82%，5年存活率與惡性腫瘤相仿。可見心力衰竭嚴重影響著患者的生命質量和壽命，故心力衰竭的防治一直成為現代醫學界研究領域中的核心問題。

差異蛋白質組學是當今生物學研究領域的一個重要組成部分，它通過比較生理和病理狀態下細胞或組織中蛋白質的表達和修飾，揭示其疾病的病理生理過程具有重要意義。iTRAQ技術是由美國應用生物系統公司(ABI)2004年開發的同位素標記相對和絕對定量(Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation，iTRAQ)技術，它是建立在iTRAQTM試劑的基礎上，可同時對多種樣品進行絕對和相對定量的研究方法，該項技術廣泛應用于現代生命科學領域[3-6]。該方法具有較好的精確性和可重復性，故彌補了DIGE及ICAT的不足。迄今為止多數方法只能進行2個蛋白質樣品的同步比較，目前iTRAQ試劑能夠同時進行8個樣品的標記和同步分析比較。隨著蛋白質組學、質譜技術、軟件分析系統的不斷的發展和改進，iTRAQ技術很有可能成為定量蛋白質組學研究中的支撐技術[7]。

蛋白組學與證候研究的結合，可以在一定層面上揭示中醫證候的內涵，對證候的相關指標體系的研究起到了積極的推動作用。我們利用iTRAQ技術結合二維液相色譜-串聯質譜分析CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證組的相關表達差異蛋白，并為蛋白質層面的疾病與證候生物學基礎提供部分實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2009年4月至2010年12月內蒙古醫學院附屬醫院心內科、急診心內科、蒙醫科、體檢中心等收治的慢性心力衰竭患者45例，隨機分為CHF氣虛血瘀證組，CHF氣陰兩虛證組，健康對照組，每組15例，性別不限。在中醫理論指導下，嚴格遵循流行病學的原則，采用橫斷面的調查方法，采集信息以面訪方式進行記錄，歸檔。每5例混合為一個樣品，每組3個樣品，共計9個樣品。

1.2 診斷標準 1)診斷依據慢性心力衰竭診斷標準及分期依據(2007年中國慢性心力衰竭診斷治療指南)；2)證候診斷依據2002年國家食品與藥品監督管理局頒布的《中藥新藥臨床研究指導原則》，且由3名中醫醫師盲診，經辨證一致者入選。

1.3 試劑與儀器 臺式電動離心機(80-1,杰瑞爾);萬分之一天平(HangPingFA1004,上海);超聲儀(KQ-250DE);數顯電熱培養箱(HPX-9082ME,上海博訊);飛行質譜儀(MALDETOF，Bruker);振蕩器(HY-5型,江蘇省金壇市);高效液相色譜(HPLC)(島津半制備型HPLC系統流動相，A液：10 mM KH2PO4，25% ACN，用H3PO4pH3.0；B液：10 mM KH2PO4，2M KCl，25% CAN，用H3PO4pH3.0，陽離子交換柱：Phenomenex Luna 5u SCX 100A)；制冰機(SIM-F124，sanyo);納升級液相色譜(Nano LC，Proxeon Easy nano-LC，流動相A：H2O，0.1%FA，B：ACN，0.1%FA，色譜柱，C18反相色譜微柱(100 mm×75 μm)，5 micron)；純水機(Milli-Q，Millpore);酶標儀(BIO-TEX公司,德國);高壓滅菌器(Labo Autoclave，sanyo)等。實驗材料包括：Triton X-100(Amersham Bioscience)；BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce)；iTRAQ?Reagent-8 Plex Multi-plex Kit(113-119,121)(Applied Biosystems Foster City，CA 94404 USA，批號：1006023)；proteoExtract Albumin/IgG Removal Kit Cat.No.122642(Merck)；疏水性C18柱(StrataTMXPalentpending Polymeric Reversed Phase)(phenomenex)；2D QUANT Kit(GE Healthcare)；Triethylammonium bicarbonate buffer(TEAB)(Sigma-Aldrich)；Trypsin Gold，Mass Spectrometry Grade(promega)；Zip Tip?Pipette Tips(Millipore)；TFA(MERCK)；CHCA(BRUKER)；CAN(fisher scientific)；IAM(CALBIOCHEM)。

1.4 方法 1)樣品制備：在患者入院第2天早晨6:00—8:00取被檢者空腹靜脈血5 mL，裝入血清管，4 ℃，3 000 r/min，離心20 min，取上清，分裝至凍存管，-80 ℃保存；2)血清高豐度蛋白的去除；3)樣品沉淀及重溶；4)蛋白烷基化；5)2D QUANT Kit(GE)定量及消化；6)蛋白復溶及標記；7)標記肽段混合及SCX分離；8)除鹽及凍干；9)樣品復溶，MALDI檢測及上樣；10)數據庫搜索及統計學處理。

1.5 統計學方法 NCBI homan庫；Mascot軟件。得到質譜的wjf、xmi文件格式的數據用數據庫搜索，軟件提取搜索結果中匹配肽段的保留時間、報告離子的強度等信息進行蛋白鑒定及定量。數據都遞交至NCBI(homan庫)人數據庫進行相應的搜索。我們運用david(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對差異蛋白進行富集分析，數據分析采用fisher Exact test方法。鑒定到2個以上來自于同一個蛋白的肽段，認為此蛋白可信，兩兩比值不等于1的肽段認為存在差異。我們在本此實驗中選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且P值<0.05，認為二者之間存在顯著差異，正負值表示該蛋白顯著上調或顯著下調。

2 結果

我們使用iTRAQ技術結合二維液相色譜-串聯質譜分析方法對健康對照組、CHF氣虛血瘀證組、CHF氣陰兩虛證組的血清蛋白質組進行了較為系統的研究，研究設計每組15例，每5例混合為一個樣品，每組3個樣品，共計9個樣品。比較CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組分別與健康對照組比較，找出各組表達的差異蛋白，具體結果及詳細描述如下。

2.1 流行病學一般資料 30例CHF患者合并疾病情況分析，所有入組CHF病例基礎病因均為冠心病，其中合并高血壓者14例，合并陳舊心梗者7例，合并糖尿病和高血脂者各3例。見表1。

表1 30例CHF患者合并疾病的構成情況[例(%)]

2.2 30例CHF患者性別年齡分布情況 所有入組CHF病例在性別及年齡上比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表2。

表2 30例CHF組性別年齡分布情況

2.3 2與健康對照組比較各組間表達差異的蛋白質 我們選取以119(或121)標記的健康對照組的蛋白質作為參照，平行檢測，3次生物學重復。那么，3次iTRAQ的結果如何呢？經分析得知，第1組已鑒定的蛋白質和表達差異蛋白質分別是387個和34個，第2組已鑒定的蛋白質和表達差異蛋白質分別是305個和29個，第3組已鑒定的蛋白質和表達差異蛋白質分別是386個和36個。去除冗余，實際得到58個蛋白，這58個蛋白質在健康對照組、CHF氣虛血瘀證、氣陰兩虛證組血清中分別被標記了已知的同位素。比較某一蛋白質在不同組分之間的表達差異，我們通過該蛋白在不同標記下的峰面積之間的比值來計算。我們選取兩兩比值≥1.2或≤-1.2，且同時滿足P<0.05時，我們認為該蛋白在相應組中明顯上調或明顯下調。

2.4 與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組表達差異的蛋白質 選擇以119(或121)標記的健康對照組的蛋白質作為參照，保證每一個樣品技術重復2次并且在3次iTRAQ實驗中至少2次或3次出現表達差異的蛋白質作為入選標準，共找到CHF氣虛血瘀證表達差異蛋白質16個，其中11個蛋白質表達上調(向上的箭頭)，5個蛋白質表達下調(向下的箭頭)。具體分析結果見表3。

表3 與健康組比較CHF氣虛血瘀證差異蛋白質列表

注：1、差異倍數≥1.2倍；2、*示：NCBI數據庫中未找見的無名蛋白質

表4 與健康組比較CHF氣陰兩虛證差異蛋白質列表

注：1、差異倍數≥1.2倍；2、*示：NCBI數據庫中未找見的無名蛋白質

2.4 與健康對照組比較CHF氣陰兩虛證組表達差異的蛋白質 選擇以119(或121)標記的健康對照組的蛋白質作為參照，保證每一個樣品技術重復2次并且在3次iTRAQ實驗中至少2次或3次出現表達差異的蛋白質作為入選標準，共找到CHF氣陰兩虛證表達差異蛋白質15個，其中10個蛋白質表達上調(向上的箭頭)，5個蛋白質表達下調(向下的箭頭)。具體分析結果見表4。

3 討論

本研究擬通過運用iTRAQ技術結合二維液相色譜-串聯質譜技術研究CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證患者血清樣品，比較并歸類血清表達差異的蛋白質，篩選及可能做為CHF證候特異性標志物。對表達差異的蛋白進行歸類，試圖尋找可能與CHF中醫證候有關聯的生物學指標或群，進而為CHF證型規范化研究提供實驗依據，有望更好的指導臨床。

3.1 與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組表達差異的蛋白質

3.1.1 表達上調的蛋白質 1)代謝紊亂：物質在體內的消化、吸收、運轉、分解等與生理有關的代謝過程稱為物質代謝。物質代謝既有同化作用又有異化作用。提起代謝紊亂CHF氣虛血瘀證組在本實驗中主要涉及到脂質代謝紊亂及透明質酸代謝異常。前者主要包括載脂蛋白E、載脂蛋白D前體，而后者主要包括ITIH1、IHRP。眾所周知，脂類向身體各部位的運輸是靠脂蛋白(Lipoproteins)來完成的。血漿中的各類脂蛋白都由蛋白質和脂類兩部分組成，其蛋白質部分主要為載脂蛋白(Apolipoprotein，apo)。目前發現的載脂蛋白有20種之多，主要有apoA、apoB、apoC、apoD、apoE、apoJ等類型。主要在肝(部分在小腸)合成，載脂蛋白是運載脂類物質及穩定脂蛋白的結構等功能。載脂蛋白D(Apolipoprotein D，apoD)是一個29 kD的糖蛋白，它最初是在人血漿的高密度脂蛋白中被分離出來的。apoD在結構上與其他類型的載脂蛋白存在很大的差異，被歸入脂肪促成素家族。apoD可以與膽固醇、黃體酮、膽紅素等多種疏水性小分子結合，另外，apoD在多種脊椎動物的各類組織中廣泛表達，提示apoD在脊椎動物中重要的生理功能。近來研究表明，apoD可作為多種癌癥及神經系統疾病的早期診斷標記物而備受關注[8]。在本實驗中我們發現CHF氣虛血瘀證組有載脂蛋白D前體，并且表達上調，可能說明CHF氣虛血瘀證有脂類代謝的變化。除此之外還有ApoE，它是存在于多種脂蛋白顆粒中，是正常人血漿脂蛋白中重要的載脂蛋白成分，主要功能為運輸并介導某些脂蛋白與相應的受體。在神經系統中，ApoE參與磷脂及膽固醇的動員和再分布，調節脂質代謝、維持膽固醇平衡，同時還參與神經系統發育和損傷后的修復過程。ApoE主要由肝臟產生，還有腦、脾、腎上腺等組織和單核巨噬細胞也合成ApoE(約為總量的10%～20%)[9]。另有文獻指出ApoE可作為肝細胞癌HCC的一個組織學標記物[10]。間α胰蛋白酶抑制劑(Interatrypsininhibitor，ITI)家族是在人和動物的血液中存在的一種蛋白質[11]，ITI包括ITIH1，ITIH2，ITIH3，ITIH4和ITIH5，以及輕鏈bikunin。Bour-guignon對人類健康肺組織和惡性組織中ITI輕鏈和重鏈進行免疫組化觀察，發現不但ITI輕鏈與惡性腫瘤的發生有關，ITI重鏈也與腫瘤的惡性轉化有關[12]。本實驗中發現的此類蛋白質有間-α胰蛋白酶抑制劑重鏈(ITIH1)、α-胰蛋白酶抑制劑家族重鏈相關蛋白(IHRP)在CHF氣虛血瘀證組均上調。ITI家族所有成員在惡性腫瘤的發展進程中均起著不同的重要作用[13]。2)補體相關：補體是存在于正常人和動物血清與組織液中的一組經活化后具有酶活性的蛋白質。主要承擔機體調節、免疫、炎性反應、信號轉導等多種功能。本實驗中CHF氣虛血瘀證組與補體系統相關表達差異的蛋白質有C9、補體C5前蛋白原，且在CHF氣虛血瘀證組的表達均上調。有研究證明腦出血后補體級聯激活C9高表達并有沉積[14-15]。另有研究指出，與良性卵巢腫瘤比較，在卵巢上皮性癌中，銅藍蛋白、C9蛋白表達上調[16]。3)免疫相關：α-2巨球蛋白前體(Alpha-2-macroglobulin precursor)為α-2巨球蛋白的前體物質。α-2巨球蛋白是血漿中一種主要的四聚體糖蛋白，是由肝細胞與單核吞噬細胞系統中合成，是所有已知內蛋白酶的循環性抑制劑。對人體許多病理、生理過程發揮重要作用[17]。它與淋巴網狀系統細胞的發育和功能有密切聯系。該蛋白在CHF的氣虛血瘀證組中表達上調。4)炎性反應相關：與炎性反應相關蛋白質主要是血清淀粉樣蛋白A-4蛋白前體(SAA4)。我們知曉血清淀粉樣蛋白A(Serum Amyloid A，SAA)通常被認為是炎性反應的主要蛋白之一，SAA家族有4個成員，分別按被發現的順序命名為SAA1、2、3、4，最近越來越多的報道SAA參與了多種惡性腫瘤發生發展[18]。5)細胞凋亡相關：半乳糖凝集素-3結合蛋白(Galectin-3-binding Protein)為一種β半乳糖苷結合的凝集素，是脊椎動物半乳糖凝集素家族中的一種亞型，相對分子質量為31 000，它可通過與配體的反應發揮很多生物學效應。半乳糖凝集素3在活化的嗜堿性細胞、巨噬細胞、上皮細胞及一些感覺神經元中表達最多。它主要存在于細胞漿中，尚可存在于細胞核、表面或胞外[19]。現已證實半乳糖凝集素3在許多上皮細胞和免疫細胞中有表達且參與多種細胞功能，尤其在mRNA剪接過程中發揮重要的作用，它還參與細胞生長，免疫調節等。有一項研究證明，惡性腫瘤中半乳糖凝集素3表達增高可能與它刺激細胞增殖及抑制細胞凋亡相關[20]。本實驗中半乳糖凝集素-3-結合蛋白在CHF在氣虛血瘀證組表達上調。6)無名蛋白質：發現2個NCBI庫中無名蛋白質分別為gi|37138和gi|16553735，前者13個肽段被標記，后者2個肽段被標記。

3.1.2 表達下調的蛋白質 1)代謝相關：代謝相關的蛋白質主要有胰蛋白酶抑制劑、TBPA、載脂蛋白C-Ⅲ前體，下面逐一探討。胰蛋白酶抑制劑(Trypsin Inhibitor)，它抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，從而阻止胰腺中其他活性蛋白酶原的激活及其他的自身激活。本次實驗中CHF氣虛血瘀證組該蛋白表達下調。TBPA是甲狀腺素運載蛋白的前體物質，有報道稱，肺淀粉樣病變的淀粉樣物的來源主要來自血漿甲狀腺素運載蛋白。本實驗中發現，與健康對照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組下調。我們曉得載脂蛋白C是目前所知載脂蛋白中分子量最小的一類，在本實驗中與健康對照組比較CHF氣虛血瘀證組ApoCⅢ前體下調。50年代Shore等分別報道，VLDL中ApoA和B外，還有第3種載脂蛋白。2)免疫相關：DBP是一種具有多種功能的蛋白質，主要參與維生素D的轉運和清除肌動蛋白，并具有免疫調節作用[21]。本實驗中CHF氣虛血瘀證組表達下調。3)炎性反應相關：我們知道炎性反應在冠心病發病過程中的作用，但是炎性反應是否參與CHF的形成機制呢？我們在CHF組中發現銅藍蛋白前體(Ceruloplasmin Precursor)，是銅藍蛋白(CP/CER)的前體物質。CP是血清中的含銅蛋白質，結合6或7個銅離子，亮藍色，在銅解毒和貯存以及鐵代謝中起重要作用，有可能參與清除氧自由基和超氧陰離子。本實驗中發現，與健康對照組比較該蛋白在CHF氣虛血瘀證組表達下調。

3.2 與健康對照組比較CHF氣陰兩虛證組表達差異的蛋白質

3.2.1 表達上調的蛋白質 與健康對照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達上調的蛋白質有C 9、IHRP、α-2巨球蛋白前體、ITIH1、SAA4前體、胰蛋白酶抑制劑、TBPA、補體C5前蛋白原、ApoC-II和gi|16553735，以上10個蛋白在前面均已敘述過，在此省略。

3.2.2 表達下調的蛋白質 與健康對照組比較，CHF氣陰兩虛證組表達下調的蛋白質有DBP、銅藍蛋白前體、半乳糖凝集素-3結合蛋白、前血清淀粉樣蛋白P(Pre-serum Amyloid P Component，SAP)、免疫球蛋白重鏈可變區(Immunoglobulin Heavy Chain Variable Region，IgVH)，其中前3者均已在前面敘述過，下面主要詳細探討后兩者蛋白質。

SAP是一種非纖維血漿糖蛋白，屬于pentraxin家庭，系由肝臟合成的糖蛋白，廣泛存在于所有脊椎動物的血液中，人血清中的含量約為30～50 mg/L，它由10個相同的分子量均為25KD的亞基組成，亞基間通過非共價鍵連接而成2個完全相同的環狀平行五聚體蛋白質[22-23]。SAP通過Ca2+依賴性方式與多種配體結合，包括纖連蛋白、黏多糖、C4b結合蛋白、補體成分、聚合IgG、C反應蛋白(CRP)、淀粉樣原纖維、膠原蛋白等。SAP可能通過激活并調節補體系統干擾脂蛋白代謝，參與淀粉樣蛋白的形成[24]。張鳳珍等報道稱[25]，血漿HDL的生理功能是完成膽固醇的逆轉運，將肝外組織膽固醇轉運到肝內轉化排泄，故HDL有利于降低血膽固醇，將其視為有抗動脈粥樣硬化作用。VLDL可將肝內合成的內源性TG轉運出肝到外周組織，經LPL催化降解為脂肪酸和甘油。LDL將肝內合成內源性膽固醇轉運到外周組織，故將其視為致動脈粥樣硬化因子。人血清中，SAP與HDL呈負相關，與VLDL呈正相關。SAP與血漿HDL、VLDL結合，具有較高親和力，而不與LDL結合。研究還顯示，SAP的功能與連接脂蛋白相互作用的能力相關，特別在動脈粥樣硬化和淀粉樣病變的發病機制中起了重要作用。還發現，它有助于保持淀粉樣蛋白沉積的穩定。與健康對照組比較SAP在CHF氣陰兩虛證組表達下調，說明有脂類代謝的變化。

免疫球蛋白重鏈可變區(IgVH)，重鏈大小約為輕鏈的2倍。根據H鏈抗原性的差異將其分為5類：μ、γ、α、δ和ε鏈，不同H鏈和L鏈(κ或λ鏈)組成完整Ig的分子分別稱之為IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ鏈上含有4個肽，μ和ε鏈含有5個環肽。Ig是體液免疫應答中，免疫功能最重要的免疫分子。該蛋白質在CHF氣陰兩虛證組表達下調。

總之，利用iTRAQ技術結合二維液相色譜-串聯質譜技術檢測結果在一定程度上能夠反映CHF氣虛血瘀證及氣陰兩虛證的生物學基礎，可能更客觀的評價證候特征，有可能為CHF證候的診治提供新的血清標志物。但是，機體是一個完整的、相互聯系的復雜體系，而證候則是對機體在疾病某一階段的整體狀態的反應。因此，很難簡單地用一個或幾個蛋白質的變化來囊括此狀態。某一個蛋白質的上調或下調往往會影響上下游幾個蛋白的表達狀態。需要從“同病異證”和“異病同證”的蛋白表達譜差異中尋找證候的共同性和差異性，從而揭示證候的科學內涵。故，我們在將來的研究中，更應該深入研究，在中醫證候學領域進行更廣、更深的研究。