核桃莖段組織培養無菌芽苗的誘導

胡文斌 張少飛 孫娜 宮崢嶸

摘要：以改良DKW培養基為基本培養基，附加不同質量濃度的6-BA和IBA，對核桃進行莖段組織培養初代培養基篩選，同時進行繼代培養，誘導無菌芽苗。結果表明：使用75%乙醇消毒60 s，再用0.1%氯化汞消毒8 min，可以達到最佳滅菌效果；最佳初代培養基為改良DKW培養基+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L，繼代培養芽苗生長良好。

關鍵詞：核桃組培；快繁；污染；褐化

中圖分類號：S664.1 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）05-0036-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.05.012

A Preliminary Report on Introduction Test of 12 New Oil Flax Strains

in the Dry Farming Area of Southern Ningnan

ZHANG Wei， LU Junwu， CAO Xiuxia， QIAN Aiping， YAN Kuanjiang

（Guyuan branch of Ningxia Academy of agricultural and Forestry Sciences， Guyuan Ningxia 756000， China）

Abstract：A introduction test of 12 new oil flax strains was carried out in the dry drilling cultivation conditions of the mountainous areas of Southern Ningxia. The results show that the seed yield of the new oil flax strain 09025 was 2 384.66 kg/hm2， 308.20 kg/hm2， 14.84% higher than of the local strains Ningya17， it is the first in all the tested strains， which increase in production was extremely significant. Its comprehensive traits are excellent； plant height is suitable； drought resistance stand out； the plants grow well；degree of uniformity is outstanding. Expression of Comprehensive Characters of the new oil flax strains 090252， and it is suitable to be grown in the dry land in the southern mountainous areas of Ningxia.

Key words：Oil flax（Linum usitatissimum L）；Strain；Ningnan mountainous areas；Dryland Area；Introduction

核桃（Juglans regia .L）古稱胡桃或羌桃，屬胡桃科胡桃屬，與榛子、板栗、腰果并稱為世界四大干果[1 ]。核桃含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素及礦物質，營養豐富，具有多種保健及藥用價值[2 - 3 ]。核桃為我國重要經濟栽培樹種，但目前主要是以實生苗嫁接的方式進行繁殖，需要大量的接穗，且切口處易發生氧化褐變，成活率很低、周期長且不穩定，易受天氣影響。扦插繁殖基本不能成活，使得良種的繁殖效率極其低下[4 ]。

植物組織培養快繁技術，以繁殖系數高、速度快、育種時間短等優點，成為目前植物育苗的研究熱點之一，具有很高的商業價值[5 ]。我們以隴南地區最為常見的核桃品種遼核1號為材料，研究了其莖段組織培養的最佳消毒時間及初代培養的最佳培養基配比，并進行繼代培養，誘導出無菌芽苗，以期為核桃快繁體系的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

指示核桃品種為遼核1號，2～4年生嫁接苗，采自成縣植物觀光園。取當年生枝條的休眠芽和嫩枝莖段進行離體培養。

1.2 試劑

6-卞氨基嘌呤（6-BA），由上海藍季科技發展有限公司生產；3-吲哚丁酸（IBA），由中國醫藥上海化學試劑公司生產。

1.3 外植體消毒和接種方法

莖段于每年5 — 8月取材，一般在晴天早上9：00左右進行。先在流水下沖洗過夜，用軟毛刷沾取肥皂液刷洗干凈，再進行表面消毒處理。置于超凈工作臺上，剪成長2～3 cm的帶芽莖段，用75%酒精消毒60 s，然后用無菌水沖洗2～3次，再用0.1%氯化汞溶液消毒。試驗設氯化汞消毒時間6、8、10 min，共3個處理，每個處理20瓶，每瓶接種1個外植體。接種時先將已消毒的外植體用無菌水反復沖洗5次。在無菌條件下切去下部有褐化的傷口，將消毒過的材料正插于培養基上進行培養。

1.4 培養基及培養條件

以改良DKW培養基為基本培養基，附加6-BA，IBA、蔗糖30 g/L、瓊脂粉 8 g/L，pH 5.8～ 6.0。培養條件：培養溫度為（25±2） ℃，相對濕度為60%，光照時間12 h/d，光照度2 000～2 500 lx[6 ]。分別于7、14、21、28、35、42 d統計接種材料的污染率、褐化率，死亡率和成活率，以及污染的類型。

1.5 激素質量濃度確定

以改良DKW培養基為基本培養基，附加不同質量濃度的6-BA和IBA，將單芽莖段接種于培養基上，研究激素配比對核桃萌芽的影響。試驗設附加6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.05 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L、6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.05 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L、6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，共6個處理，3次重復。接種30 d后，觀察芽的分化、增殖與生長情況。

1.6 繼代培養

腋芽生長至3 cm左右時在無菌環境中將其小心取下，接種于篩選出的生長狀態最好的培養基中，進行增殖培養。

2 結果與分析

2.1 外植體最佳消毒時間的確定

由圖1、圖2可知，隨著消毒時間的延長，外植體的污染率和褐化率在逐漸下降。但通過與圖3進行比較分析可知，氯化汞消毒8 min時，萌芽情況最好，高于其他兩個處理。綜合分析可知，核桃外植體的消毒方法是采用75%乙醇消毒60 s，再用0.1%氯化汞消毒8 min。

2.2 初代培養基的確定

從表1、圖4可以看出，經過28 d的培養，所有處理外植體生長狀況良好，其中以6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L處理萌芽率最高，增殖效果最好。因此，最佳增殖培養基配方確定為改良DKW培養基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。

2.3 繼代培養狀況

將萌發的腋芽小心剪下，轉接于改良DKW培養基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L中。經過42 d的培養，外植體生長狀況良好（圖5）。

3 結論與討論

對遼核1號核桃莖段組織培養快繁的研究表明，用75%乙醇60 s，0.1%氯化汞消毒8 min為最佳消毒時間。選擇改良DKW為基本培養基，最佳初代及繼代培養基配比為：改良DKW培養基+ 6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH 5.8。

核桃組培過程中污染的發生及組織的褐化是核桃組織培養過程中最常見的現象，也是核桃組織培養過程中的兩大難題。這是由于微生物體積極其微小，難以肉眼觀察，生活力強，容易傳播，再加上操作者的操作手法、習慣不同，以及外植體本身生理狀態和環境因素的影響，導致污染經常發生。褐化是外植體組織內酚類物質經多酚氧化酶氧化形成褐色的醌類物質的現象，褐化后的外植體由于醌類物質對其抑制而生長緩慢，甚至將導致外植體死亡[7 ]。目前，核桃組培可采用MS、DKW、WPM培養基等，但是DKW培養效果最好[8 ]。而污染和褐化始終是核桃組織培養過程中的兩大頑疾，常用消毒劑氯化汞能有效控制污染，但處理時間過長會殺死植物組織，雖能降低污染率，但外植體的成活率也隨之下降，且氯化汞為重金屬物質，會對環境造成污染[9 ]。張燕 等[10 ]利用青霉素和多菌靈處理外植體進行抗污染研究，取得了很好的效果；苗玉青等[11 ]研究發現，在進行初代培養時，利用低溫處理外植體后，適當的暗培養可以降低褐化程度。

我們經過120 d的試驗研究，采用改良DKW培養基，進行初代培養，篩選出了最佳初代培養基配比，同時進行了繼代培養，誘導出無菌芽苗，也對研究過程中出現的污染及褐化問題進行了很好的處理，培養過程中沒有出現大面積的污染及褐化，具有統計學意義。下一步可進行組培苗生根培養、煉苗及馴化移栽等研究。

參考文獻：

[1] 張毅萍. 世界及我國核桃生產概況和幾個問題[J]. 林業科技與市場信息，2002（3）：52-55.

[2] 封斌奎. 核桃營養保健功能與加工技術研究進展[J]. 陜西林業科技，2015（1）：10-13.

[3] 王新平，孫慧英. 核桃的營養藥用價值及加工利用[J]. 現代園藝，2017（2）：20.

[4] 楊海波，王 娟. 核桃外植體的組織培養[J]. 安徽農業科學，2011，39（28）：17156-17157.

[5] 于艷萍，侯立群. 核桃組織培養技術研究綜述[J]. 山東林業科技，2012（5）：117-120.

[6] 楊美平. 遼寧1號核桃組織培養技術[J]. 河北果樹，2014（4）：46.

[7] 張 燕，何 暉. 核桃組織培養中外植體褐變多酚氧化酶活性的控制[J]. 安徽農業科學，2010，38（20）：10553-10556.

[8] 張小紅，閔東紅，康 冰，等. 核桃組織培養中外植體材料的初代培養研究[J]. 陜西林業科技，2005（2）：6-8.

[9] 伊書亮，郭國寧. 核桃組織培養研究綜述[J]. 安徽農學通報，2009，15（11）：58-60.

[10] 張 燕. 核桃組培快繁技術的研究[D]. 晉中：山西農業大學，2004.

[11] 苗玉青，李 冠. 薄皮核桃組織培養與快速繁殖[J]. 新疆農業科學，2010，47（3）：503-507.

（本文責編：劉 赟）