基于“四時五藏陰陽”理論整體論思想的研究不同含氧量對大鼠肺、腸組織VIP、CCK及P物質表達影響的實驗觀察

李立華 邱新萍 郭霞珍

摘要目的：比較大鼠在接受不同的氧含量的刺激下，肺與回腸、結腸、空腸組織上的血管活性腸肽、P物質、膽囊收縮素的不同，探討中醫藏象的科學內涵，以及“四時五藏陰陽”理論整體論思想在中醫學臟腑概念形成中的作用和地位。方法：27只SD雌性大鼠，分成高氧組、低氧組、正常組，每組9只。正常組正常飼養；低氧組（10±1）%低氧刺激，高氧組（40±3）%高氧刺激，2組均每天刺激8 h，共7 d。用放射免疫分析的方法分別檢測3組大鼠肺、回腸、結腸以及空腸的VIP、CCK、SP含量變化。結果：正常組：肺與空腸組織上的血管活性腸肽、P物質、膽囊收縮素的表達有顯著差異，而回腸、結腸組織沒有。高氧組：肺與空腸上的血管活性腸肽、P物質的表達具有顯著差異，而回腸、結腸組織沒有；肺與回腸、結腸、空腸組織上的膽囊收縮素表達比較，差異無統計學意義。低氧組：肺與空腸組織上的血管活性腸肽、膽囊收縮素表達比較有統計學意義，而回腸、結腸組織上沒有；空腸、回腸組織上的p物質表達有統計學意義，而結腸組織上沒有。說明變化與外界環境有關。結論：在生理狀態下，肺、回腸、結腸這三者之間的聯系密切。血管活性腸肽、P物質及膽囊收縮素這3種物質是肺與大腸之間機能相關的物質基礎，其變化與外環境相關，這為中醫學《黃帝內經》“四時五藏陰陽”理論的研究提供了生物醫學的依據。

關鍵詞含氧量；表達差異；肺合大腸；血管活性腸肽；膽囊收縮素；P物質

Experimental Observation on Effects of Different Oxygen Contents on the Expression of VIP， CCK and P Substances

in the Lung and Intestine of Rats Based on “Yinyang of the Four Seasons and the Five Viscera”

Li Lihua1， Qiu Xinping1， Guo Xiazhen2

（1 Shunyi Hospital of Beijing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Beijing 101300， China；

2 Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

AbstractObjective：To discuss the scientific connotation of visceral manifestation of TCM， and the role and status of the “yinyang of the four seasons and the five viscera” theoretical holistic theory in the formation of the TCM concept of viscera， from the relationship between the lungs and the large intestine， through comparing the expression of vasoactive intestinal peptide （VIP）， cholecystokinin （CCK）， and substance P （SP） in lungs with jejunum， ileum， and colon tissues under different oxygenation index conditions. Methods：Twentyseven SD female rats were divided into hyperoxia group， hypoxic group and physiological group with 9 rats in each group. The hypoxic group was given （10±1）% oxygen concentration for 8 hours per day， and the hyperoxia group was given （40±3）% oxygen concentration for 8 hours per day. Both groups were fed for 7 days. The contents of VIP， CCK and SP in lung， jejunum， ileum， and colon of rats in each group were determined by radioimmunoassay. Results：In the normal group， the expression of VIP， CCK and SP in lung was significantly different with jejunum， and no differences with ileum and colon. Hypoxia group： Compared with the lungs， the VIP and CCK in the jejunum were significantly different， but there was no difference in ileum and colon； the SP in the jejunum and ileum was significantly different， but there was no difference in colon. Hyperoxia group： compared with the lungs， VIP， SP on the jejunum had significant differences， but no differences on the ileum and colon； CCK in lung and jejunum， ileum， colon was not significantly different. The result explained that changes were related to the external environment. Conclusion：Under physiological conditions， the lung， colon， and ileum are the most closely related to each other. It can be assumed that the lung has a close relationship with the large intestine. At the same time， three brainintestinal peptides， VIP， CCK and SP， are the material basis for the functional relationship between the lungs and the intestine. Its changes are related to the external environment， which provides a biomedical basis for the study of the theory of “yinyang of the four seasons and the five viscera” in Huangdi Neijing of TCM.

Key WordsOxygen content； Expression difference； Lungassociating with large intestine； Vasoactive intestinal peptide； Cholecystokinin； P substance

中圖分類號：R221；R2231+1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.011

依據“四時五藏陰陽”理論的整體論思想分析，中醫五臟是以五臟為中心的內合六腑、五官、五體、五華、五音等組織結構與功能作用，通過經絡的連屬，成為相互關聯的整體系統，是人體生命活動的基礎。自《黃帝內經》以降，中醫學從五臟為中心所構成的五大功能系統角度認識人體臟腑的思想，已經成為認識人體生命活動的基本要素，是中醫學理論體系認識臟腑的獨特的思維模式。其中肺和大腸之間通過經脈絡屬的關系構成了表里聯系。它們在生理、病理上都能相互影響。而研究人員在對兩者生物相關的實驗研究中發現，血管活性腸肽、P物質、膽囊收縮素這3種物質都肺、腸組織上表達，從而提示其有可能是肺與大腸相關聯的物質基礎。

生物學研究來看，P物質廣泛分布于神經纖維內，是可在外周端末梢及中樞端釋放的一種神經肽物質。在經絡研究中認為它可能是經脈信息傳遞的重要物質。血管活性腸肽（VIP）是神經遞質的一種。主要由腸道神經元釋放，存在于中樞神經和腸神經系統中。在生物體內它既是胃腸道激素，又是神經肽。其功能多樣，在肺能降低肺動脈壓，松弛支氣管平滑肌；在消化系統的主要作用是舒張腸道平滑肌，許多胃腸道疾病都與VIP水平變化有關，是目前研究胃腸道疾病的重要指標之一。有研究證實肺血管周圍分布著有P物質和VIP陽性反應的神經纖維[1]。膽囊收縮素（CCK）是一種腦/腸激素。它可以作用腸道平滑肌，使之興奮收縮。研究也已經證實肺組織上存在少量膽囊收縮素[2]，它與肺臟的疾病有密切關系[3]。我們的前期研究顯示，在組織胚胎學方面，大鼠的肺、氣管都是由原腸的前腸發展而成。結構來源相同被認為是“肺與大腸”相表里的結構基礎[4]。研究可見VIP、P物質及CCK這3種物質對肺與空腸、回腸、結腸的功能關系緊密。因此，本研究結合肺、腸之間的“神經——內分泌”相關研究，依據“天人相應”“四時五藏陰陽”理論的整體論思想，按照自然氣候環境不同空氣中含氧量也有差別的現象，我們選擇了觀察不同含氧量環境下飼養的大鼠，研究它們存在于肺腸組織之間的物質是否變化一致性，作為提供肺與大腸相合的可行性基礎，以探討中醫藏象的科學內涵，以及“四時五藏陰陽”理論整體論思想在中醫學臟腑概念形成中的作用和地位，并為其提供生物醫學的依據。

由此，我們建立了正常組（常態下飼養）和低氧組、高氧組3個實驗組，觀察不同含氧量環境下飼養的大鼠肺、腸組織VIP、CCK及P物質的表達，實驗過程如下。

1材料與方法

11材料

111動物實驗動物選擇的健康雌性SD大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。大鼠體重控制在180～200 g之間。其中每組各9只，共27只。

112試劑與儀器用于大鼠飼養的鼠籠為可變氧飼養箱。該飼養箱由本課題組設計，通過凌云博際（北京）科技有限公司代為生產。電子天平（DT系列），購置于北京天平物華醫療儀器有限責任公司提供。燃料電池氧分析儀CW2000QR，由北京精微恒氧技術開發中心生產。氧氣與氮氣，皆購于北京朝紅平氣體有限公司提供。血管活性腸肽（VIP）、P物質（SP）、膽囊收縮素（CCK）的試劑盒購于北京華英生物技術研究所。

12方法

121分組與模型制備低氧組大鼠模型的制備參考以往的成熟模型[5]。采用隨機分組的方法，將9只大鼠置于可變飼養箱中。以10 L/min的速度輸入氧氣，使氧濃度維持在（10%±1）%，保持箱內氧濃度不變。

高氧組大鼠模型的制備[6]參考以往的文獻制備模型。隨機選取9只大鼠放置于鼠籠中，以10 L/min輸入氧氣，當氧氣濃度達到40%后，再持續輸入氮氣（1～2 L/min）使氧濃度維持在（40%±3）%，保持氧濃度不變。

正常組大鼠不做任何處理，在正常代謝籠中喂養。

122干預方法低氧組大鼠和高氧組大鼠每天分別給予低氧、高氧刺激，持續8 h，溫度維持在25 ℃，濕度60%～70%。正常組大鼠不做任何處理。3組都在造模7日后取材。

123檢測指標與方法7 d后取材：將肺、回腸、結腸、空腸組織取出后，用生理鹽水清洗后，放置于-20 ℃冰箱保存。檢測指標VIP、CCK、P物質均用放免試劑盒進行檢測。

13統計學方法數據應用SPSS 220進行統計學處理，組間比較采用方差分析，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21環境含氧量不同對大鼠肺、腸組織的影響在這個研究中，我們將把實測到的每組各部組織數據進行統計，并將低氧與高氧組分別與正常組進行兩2組間比較，觀察不同含氧量環境下飼養的大鼠肺、腸組織VIP、CCK及P物質的表達所存在差異的情況，確認環境含氧量不同對大鼠肺、腸組織的影響狀況。

211各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上的VIP含量比較數據統計結果說明：在低氧組和高氧組的回腸及結腸組織實測到的VIP含量，分別與正常組實測到的回腸及結腸組織VIP含量進行比較，有統計學意義。低氧組與正常組肺、腸組織的VIP含量比較，差異均有統計學意義。見圖1。

212各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上P物質含量比較數據統計結果說明：在低氧組和高氧組的肺、空腸、回腸及結腸組織上測到的SP含量，分別與正常組測到的肺、空腸、回腸及結腸組織SP含量作比較，差異均有統計學意義。見圖2。

213各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上CCK含量的比較數據統計結果說明：在低氧組和高氧組的空腸部位實測到的CCK含量，分別與正常組實測到的空腸部位VIP含量進行比較，差異有統計學意義。2組在回腸與結腸部位的CCK含量與正常組在回腸與結腸部位的CCK含量進行比較，差異無統計學意義，但能看到下降的趨勢。見圖3。

圖3各組大鼠肺、空腸、回腸、結腸組織上CCK含量的比較

從上述分別在低氧、高氧與正常環境中飼養的3組大鼠，所測得的肺、腸組織VIP、CCK及P物質的表達數據來看，低氧和高氧環境下飼養的與正常環境下飼養的存在差異，尤其是在一些相同部位的數值有統計學意義。如在肺、空腸、回場及結腸組織VIP和SP的含量低氧組與正常組比較，差異有統計學意義；在CCK含量的測定中，我們看到低氧和高氧組在肺與空腸的部位與正常組比較，差異有統計學意義。

其他數值的變化雖然沒有達到統計要求，但也有不同。由此說明，外界環境對內在臟腑的影響是客觀存在的，具有物質基礎。

22不同含氧量對大鼠肺腸組織的影響在這個研究中，我們將對低氧、高氧與正常組組內肺組織與各腸段組織VIP、CCK及P物質的表達分析，分別把實測到的每組肺與各腸段組織數據進行統計，探討肺與腸相關性聯系的生物學基礎。

221不同含氧量環境對大鼠肺組織與各腸段組織VIP含量的影響實驗觀察了在不同含氧量環境中飼養的大鼠的狀況，并對其肺組織與各腸段組織VIP含量的相關性變化進行了比較分析。實驗結果說明，3個組在大鼠肺與回腸、結腸組織上的VIP含量差異無統計學意義。肺與空腸組織上的VIP含量差異有統計學意義。

222不同含氧量環境對大鼠肺組織與各腸段組織SP含量的影響我們對在不同含氧量環境中飼養的大鼠的肺組織與各腸段組織SP含量的相關性變化進行了測定、比較與分析。實驗結果說明，3個組在大鼠肺與結腸組織上的SP含量差異無統計學意義。每一組的肺與空腸組織上的SP含量差異有統計學意義。低氧組的肺組織與回腸組織上的含量的比較，差異有統計學意義。

223不同含氧量環境對大鼠肺組織與各腸段組織CCK含量的影響我們對在不同含氧量環境中飼養的大鼠的肺組織與各腸段組織CCK含量的相關性變化進行了測定、比較與分析。實驗結果說明，3個組在大鼠肺與回腸、結腸組織上的CCK含量差異無統計學意義。在高氧組肺與空腸組織上的CCK含量也不存在統計學意義。正常組與低氧組的肺組織與空腸組織CCK含量差異有統計學意義。

綜上結果可見，正常組大鼠的肺與空腸比較，VIP、CCK、SP的含量有明顯差異，（P<005），回腸、結腸上的表達差異無統計學意義（P>005）。低氧組的肺與空腸上的VIP、CCK表達差異有統計學意義（P<005），而回腸、結腸上表達差異無統計學意義（P>005）；肺與空腸、回腸上的SP表達差異有統計學意義（P<005），而結腸上表達無明顯區別。高氧組肺與空腸比較，VIP、SP表達差異有統計學意義（P<005），回腸、結腸上差異無統計學意義（P<005）；肺、空腸、回腸、結腸上的CCK表達差異無統計學意義（P>005）。上述結果可見與肺和大腸相關的物質，在外界環境變化的情況下，仍然保持著同步的變化特點，證實中醫學肺合大腸的觀點存在生物學基礎。

3討論

31環境含氧量不同對大鼠整體狀況的影響我們知道人體生存依賴的氧濃度為（20±1）%。如果氧濃度低至（10±1）%的情況下，視為低氧狀態。低氧下氣體交換障礙可形成呼吸衰竭，對肺的直接影響尤為嚴重[7]，以往的研究發現，在低氧刺激下，肺部明顯水腫，組織膨大，血管壁彈性下降且變硬，還有個別瘀血現象。在造模的過程中，我們也發現大鼠不僅出現肺臟組織的病理學改變，大腸也出現糞質堅硬等病理改變，結合相關物質的檢測，說明低氧同時對肺和大腸均產生刺激作用。

目前把氧濃度達到80%～100%的為高濃度氧；達到60%～70%的為中濃度氧。長期高氧狀態可引起一定的毒性作用，使機體抵抗力下降，可加重流感病毒對新生鼠的感染[8]；長期高氧影響腸空泡形成使吸收能力下降，以及腸漿膜和亞黏膜血管舒張[9]。持續高氧（氧濃度為95%）刺激，還可降低肺組織血管內皮生長因子[10]，從而影響肺功能。7 d后，會導致大鼠肺組織的病理改變[11]，肺組織可見出血和炎性反應細胞浸潤[12]并且持續高氧刺激，SP含量明顯降低。本次實驗高氧模型大鼠一般狀態良好，沒有顯著變化，與以往的文獻報告的大鼠在高氧狀態下，一般在7～10 d開始出現活動能力下降、毛無光澤、呼吸急促、有發紺不太相符[13]，且未出現便質堅硬等大便改變，究其原因，可能是我們為了觀察在生理狀態下，高氧對肺腸組織的影響及這兩者的相關性，對氧濃度的選擇維持在（40±3）%，屬高氧濃度的最低限，氧含量未為達到病理狀態下的高氧刺激，所以相關組織器官未出現異常。

32肺與大腸具有表里關系的神經內分泌物質基礎肺通過口鼻與外界直接相通，是體內外氣體交換的場所，在內與大腸相連屬。實驗中我們分別對3組實驗大鼠的整體狀況進行了觀察與記錄，結果可見，正常組大鼠在此過程中，一般狀態沒有改變，大便柔軟，易于排出。高氧組大鼠在造模及取材過程中發現，大鼠一般狀態良好，與造模前比較沒有明顯變化，且未出現便質堅硬等大便改變。低氧組大鼠在造模后4 d開始出現大便減少，糞質較硬。7 d后發現：肺部有損傷，出現瘀血，肺組織顏色與正常組大鼠比較明顯變暗。結腸有干結糞便聚集現象。由此證明，外界飼養環境的改變對動物是有影響的，“四時五藏陰陽”理論強調內外一體，人與自然相通應以外可以測內的思想，值得深入研究與探討。

五臟內合于六腑，是《黃帝內經》“四時五藏陰陽”理論整體論思想認識五臟的一個內容之一。大量的臨床實踐驗證，肺失宣肅，腑氣不降，則大腸傳導功能失調；腑氣不通，影響肺的“主氣”功能，則出現肺氣不宣的病證。近年來，學者們對肺與大腸相合的關系從形態結構、物質等方面做了一系列的研究，發現它們的結構來源相同[14]，且存在共同的物質聯系[15]；由于存在共同的物質基礎，所以在病理狀態下互相影響[16]。據此本研究從“肺合大腸”的觀點切入，結合外界氧含量環境的變化，觀察大鼠肺、腸組織VIP、CCK及P物質表達狀況，以探討《黃帝內經》結合外界自然變化探討內在臟腑功能，這一思維模式具有一定的科學內涵。

實驗結果發現：血管活性腸肽、膽囊收縮素、P物質雖然在肺與空腸、回腸和結腸上都有表達，但根據此次實驗結果，肺、回腸、結腸組織上的表達差異最小。在生理狀態下，這3種物質表達仍然表現出變化的穩定性一致性。故我們認為肺和大腸在生理狀態下，具有穩定的生理相關性。血管活性腸肽、膽囊收縮素、P物質有可能是肺合大腸的神經內分泌物質基礎。這3種物質的表達在高氧與低氧實驗組與正常組的比較結果差異有統計學意義，尤其是在一些相同部位的數值差異有統計學意義。如在肺、空腸、回場及結腸組織VIP和SP的含量低氧組與正常組比較，差異均有統計學意義；在CCK含量的測定中，我們看到低氧和高氧組在肺與空腸的部位與正常組比較，差異有統計學意義。其他數值的變化雖然沒有達到統計要求，但存在不同的趨勢。由此說明，外界環境對內在臟腑的影響是客觀存在的，且具有物質基礎。研究結果從理論上為中醫學《黃帝內經》“四時五藏陰陽”理論的研究提供了生物醫學的依據，同時為我們依據中醫理論開展臨床診治具有指導價值和意義。

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（2018-04-15收稿責任編輯：徐穎）（上接第1094頁）

物學或時間醫學研究的內容。其五，在發現了人體與自然、宇宙在節律上的相似性甚至一致性，“天人相應”的思想由此延伸至人需“順應天時”的思想。綜上，將“天人相應”本質視為一種“天人”空間結構是可行的。

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