姜黃素對人胰腺癌細胞增殖抑制作用及對Wnt信號通路的影響

宋魏崔云 張建波 孫淼淼 夏慶欣

摘要目的：探究姜黃素對人胰腺癌SW1990細胞增殖抑制作用及對Wnt信號通路的影響。方法：低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細胞分別以終濃度為20、50、100 μmol/L姜黃素處理，100 μL/孔，對照組細胞則以等體積生理鹽水處理，分別干預24、48、72 h。以噻唑藍（MTT）法及AnnexinV/FITC雙染法分別檢測人胰腺癌細胞SW1990增殖及凋亡情況，反轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）法及細胞爬片免疫細胞化學技術檢測人胰腺癌細胞SW1990 β鏈蛋白（βCatenin） mRNA及βCatenin蛋白表達情況。結果：干預72 h后低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細胞增殖抑制率（%）分別為（459±132）、（4001±387）、（6098±597）；對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細胞凋亡率（%）（814±125）、（1304±103）、（2715±162）、（5921±146）；βCatenin蛋白免疫細胞化學（ICC）評分（分）分別為（578±056）、（442±061）、（257±058）、（138±063）。觀察組凋亡率顯著高于對照組，βCatenin mRNA相對表達量及βCatenin蛋白ICC評分顯著低于對照組（P<005），且增殖抑制率、凋亡率隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高（P<005），增殖抑制率亦隨干預時間延長逐漸升高（P<005）；βCatenin mRNA相對表達量及βCatenin蛋白ICC評分隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低（P<005）。結論：姜黃素可有效下調人胰腺癌細胞SW1990 βCatenin基因表達，抑制Wnt信號通路活化，具有顯著的增殖抑制作用，且具有明顯的時間劑量依賴性。

關鍵詞胰腺癌細胞；姜黃素；增殖抑制；Wnt信號通路

Effects of Curcumin on Proliferation Inhibition of Human Pancreatic Cancer Cell

and the Influence on Wnt Signaling Pathway

Song Wei， Cui Yun， Zhang Jianbo， Sun Miaomiao， Xia Qingxin

（Zhengzhou University Affiliated Tumor Hospital， Zhengzhou 450001， China）

AbstractObjective：To explore the proliferation inhibition effect of curcumin on human pancreatic cancer SW1990 cell and the influence on Wnt signaling pathway. Methods：The human pancreatic cancer cells SW1990 in experimentalL/M/H group were treated with final concentration of 20， 50， 100 μmol/L curcumin， 100 μL/hole， and cells in control group were treated with isovolumetric saline. Each group was intervened for 24， 48， 72 h respectively. The proliferation and apoptosis were detected by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method and AnnexinV/FITC double staining respectively， expression of βCatenin mRNA and βCatenin mRNA protein in human pancreatic cancer SW1990 cell were detected by reverse transcription PCR （RTPCR） method and cell climbing immunocytochemistry technique respectively. Results：72 h after intervened， the proliferation inhibition rates （%） of human pancreatic cancer SW1990 cell in experimentalL/M/H group were 459±132， 4001±387， 6098±597 respectively； Apoptosis rates （%） in control group and experimentalL/M/H group were 814±125， 1304±103， 2715±162， 5921±146 respectively； βCatenin protein immunocytochemistry （ICC） score （score） were 578±056， 442±061， 257±058， 138±063 respectively. The apoptosis rate in experimental groups were higher than that in control， and βCatenin mRNA relative expression and βCatenin protein ICC score were lower than those in control group （P<005）， and the proliferation inhibition rate， apoptosis rate in experimental groups increased gradually with the increase of curcumin action concentration （P<005）. Proliferation inhibition also increased gradually with the lengthen of action time （P<005）； the βCatenin mRNA relative expression and βCatenin protein ICC score decreased gradually with the increase of curcumin action concentration （P<005）. Conclusion：Curcumin can downregulate the expression of βCatenin in human pancreatic cancer SW1990 cell effectively， inhibit the Wnt signaling pathway excitation， and has significant proliferation inhibition effect， which has an obvious timedose dependence.

Key WordsPancreatic cancer cell； Curcumin； Proliferation inhibition； Wnt signaling pathway

中圖分類號：R2855文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.044

胰腺癌是臨床比較常見消化系統腫瘤，絕大多數患者發病時已經處于中晚，患者手術切除控制率不足20%，5年生存率低下，影響預后。姜黃素是由姜科植物姜黃中所提取的多酚類色素，其藥理學作用廣泛，近年來許多研究[12]證實其可有效抑制多種腫瘤的生長及轉移，參與多種抗腫瘤途徑，具有直接及間接的抗腫瘤作用，但目前有關其對人胰腺癌的抗腫瘤作用及機制研究尚少，本研究旨在探究姜黃素對人胰腺癌細胞SW1990的增殖抑制作用，并初步分析其作用機制。

1材料與方法

11材料

111細胞株人胰腺癌SW1990細胞，由中國科學院上海生物研究所饋贈。

112試劑與儀器姜黃素（純度>98%，美國Sigma公司，生產批號：B6938）；噻唑藍（MTT）試劑盒及AnnexinV/FITC雙染凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物公司）；反轉錄聚合酶鏈式反應（RTPCR）試劑盒（南京凱基生物科技發展有限公司）；兔抗β鏈蛋白（βCatenin）（美國Cell Signaling Technology公司）等。主要儀器AccuriC6型流式細胞儀（美國BD公司）；JYH27020電泳儀及T100型PCR儀（美國BioRad公司）；XSP11CC倒置生物顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）等。

12方法

121人胰腺癌SW1990細胞培養、分組與干預取人胰腺癌SW1990細胞[3]，加含10%胎牛血清及青鏈霉素的RPMI1640培養基置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2～3 d換液1次，待細胞生長至85%左右融合時以025%胰酶消化并常規傳代培養，取對數期細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，低/中/高劑量觀察組人胰腺癌細胞SW1990分別以終濃度為20、50、100 μmol/L姜黃素處理，100 μL/孔，對照組細胞則以等體積生理鹽水處理，各孔均設置8個復孔，分別干預24、48、72 h。

122MTT法檢測人胰腺癌SW1990細胞增殖情況細胞分組及處理同121，各組分別干預24、48、72 h后，加5 mg/mL MTT溶液，20 μL/孔，37 ℃孵育4 h，加二甲基亞砜，150 μL/孔，檢測各孔490 nm下吸光光度值OD490 nm，計算人胰腺癌SW1990細胞增殖抑制率=（1觀察組OD490 nm/對照組OD490 nm）×100%。實驗重復3次[4]。

123AnnexinV/FITC雙染法[5]檢測人胰腺癌SW1990細胞凋亡情況細胞分組及處理同121，干預72 h后收集各組細胞，1 000 r/m離心5 min，加195 μL緩沖液懸浮細胞，加5 μL Annexin VFITC避光孵育15 min，然后加10 μL碘化丙啶（PI）冰浴避光孵育10 min，1 h內以流式細胞儀檢測人胰腺癌SW1990細胞凋亡率，實驗重復3次。

124RTPCR法[6]檢測人胰腺癌SW1990細胞βCatenin mRNA表達情況細胞分組及處理同121，干預72 h后收集各組細胞，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。經凝膠成像分析系統進行掃描、分析，以βactin為參照，計算各組人胰腺癌SW1990細胞βCatenin mRNA相對表達量。

125細胞爬片免疫細胞化學技術[7]檢測人胰腺癌SW1990細胞βCatenin蛋白表達情況取對數期人胰腺癌SW1990細胞，調整密度為1×105個/mL，接種于6孔板，各孔底部均鋪有無菌載玻片，常規培養6 h后待細胞貼壁生長進行分組及處理，同121，各孔設6個復孔，干預72 h后，將細胞爬片以4%多聚甲醛固定15 min，免疫細胞化學技術染色，于倒置生物顯微鏡下以DAB顯色并觀察。細胞漿或細胞核呈棕黃色為陽性著色，無陽性計0分；陽性細胞1%～30%計1分；陽性細胞31%～70%計2分；陽性細胞71%～100%計3分，據著色強度無、淺黃色、黃色、棕黃色依次計0、1、2、3分，免疫細胞化學評分（ICC評分）=陽性細胞比例評分×著色強度評分。實驗重復3次。

13統計學方法應用SPSS 190統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組間比較進行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<005為差異有統計學意義。

2結果

21姜黃素對人胰腺癌SW1990細胞增殖及凋亡的影響MTT檢測顯示，干預72 h后低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細胞增殖抑制率（%）分別為（459±132）、（4001±387）、（6098±597）；觀察組細胞增殖抑制率隨姜黃素作用濃度增加及干預時間延長逐漸升高（P<005）。見圖1。AnnexinV/FITC雙染法檢測顯示，干預72 h后對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌SW1990細胞凋亡率（%）分別為（814±125）、（1304±103）、（2715±162）、（5921±146）；觀察組細胞凋亡率高于對照組（P<005），且隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高（P<005）。圖1人胰腺癌SW1990細胞增殖情況

22姜黃素對人胰腺癌SW1990細胞βCatenin mRNA表達的影響干預72 h后對照組及低/中/高劑量觀察組人胰腺癌細胞βCatenin mRNA相對表達量分別為（097±010）、（080±009）、（043±011）、（021±008）。觀察組細胞βCatenin mRNA相對表達量較對照組降低（P<005），且隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低（P<005）。見圖2。

23姜黃素對人胰腺癌SW1990細胞βCatenin蛋白表達的影響觀察組人胰腺癌SW1990細胞βCatenin蛋白免疫細胞化學（Immunocytochemistry，ICC）評分高于對照組（P<005），且隨姜黃素作用濃度增大逐漸降低（P<005）。見表1。

3討論

胰腺癌是目前醫學界難以攻克的疾患之一，中醫藥在我國腫瘤的防治中有著悠久的歷史，其將胰腺癌歸屬于傳統中醫學理論中的“黃疸”“積聚”“伏梁”“痞塊”等范疇，主要病因為六淫邪毒侵襲，情志不暢等導致氣血津液運行不暢，臟腑功能失調，導致氣滯、血瘀、熱毒、痰濕等凝結于臟腑，日久積聚而成痞塊，故治療應遵循清熱化濕、理氣散結原則。姜黃姜黃素是姜黃的主要化學成分，取自其根莖，姜黃味苦、辛，性溫，歸脾、肝經，可入氣行氣散滯、活血化瘀等。姜黃素藥理學作用廣泛，如抗癌、抗氧化、抗炎、抗纖維化等，且具有毒性小、價廉、抗癌譜廣等優勢。近年來其抗腫瘤作用受到關注，研究[8]報道，其對喉癌、乳腺癌、食管癌等具有顯著的治療效果；且體外研究[9]證實，姜黃素可對喉癌Hep2具有增殖抑制作用，且呈明顯時間劑量依賴性；蔡少鑫[10]研究報道，姜黃素可通過HIF1α抑制乳腺癌MDAMB453細胞增殖及轉移；本研究中觀察組人胰腺癌SW1990細胞凋亡率高于對照組，且增殖抑制率、凋亡率隨姜黃素作用濃度增加逐漸升高，增殖抑制率亦隨干預時間延長逐漸升高，提示姜黃素對人胰腺癌細胞也有顯著的增殖抑制作用，并呈明顯的時間劑量依賴性。

姜黃素可直接作用于細胞內相關蛋白及基因，調節細胞間信號傳導通路，達到抗腫瘤的目的。楊芳等[11]研究報道，姜黃素抑制STAT3信號通路信號轉導進而抑制胰腺癌SW1990細胞增殖。近年來研究[12]報道，Wnt信號通路異常活化會導致βcatenin積聚入核，活化下游靶基因，不僅可影響細胞增殖、分化障礙，還與腫瘤細胞免疫逃逸、浸潤轉移等密切相關，參與多種腫瘤性疾病的發生。本研究中觀察組人胰腺癌SW1990細胞βCatenin mRNA相對表達量及βCatenin蛋白ICC評分低于對照組，且隨姜黃素作用濃度增加逐漸降低，提示姜黃素對人胰腺癌SW1990細胞的增殖抑制作用可能與其顯著下調βCatenin表達，抑制Wnt信號通路活化相關，有關姜黃素抗胰腺癌的其他作用機制仍需進一步深入研究。

參考文獻

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