基于指紋圖譜結合多指標成分定量用于麻黃湯的質量評價

黃英蘭 楊芳

摘要目的：分析和評價指紋圖譜和多指標成分定量結合用于麻黃湯主要成分的定量和質量。方法：采用線性范圍試驗和加樣回收率實驗考察高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜分析方法的嚴謹性，由2個廠家各提供6個不同批次麻黃湯藥材，共12批次，以鹽酸麻黃堿對照品、桂皮醛對照品、苦杏仁苷對照品、甘草酸對照品，多指標成分定量HPLC測定，分別計算各批次麻黃湯中這4種成分的含量；同時進行指紋圖譜HPLC分析評價麻黃湯的質量。結果：麻黃湯中的有效成分鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸在各自濃度范圍內的線性關系良好，且這4種成分的平均回收率分別是1000%、1001%、9939%、9904%，RSD分別是17%、13%、11%、099%。D廠中的麻黃湯藥材樣品質量波動較大，相似度較低，而B廠中麻黃湯藥材質量波動較小，相似度較高，一致性較好。結論：麻黃湯的主要成分是鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷和甘草酸，B廠麻黃湯的藥材質量優于D廠。

關鍵詞指紋圖譜；成分；定量；麻黃湯；質量評價

Quantitative Evaluation of Mahuang Decoction Based on Fingerprint and Multi Index Components

Huang Yinglan1， Yang Fang2

（Department of Pharmacy， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China）

AbstractObjective：To analyze the quantitative and qualitative evaluation of the main components of Mahuang Decoction by quantitative analysis of fingerprint and multi index components. Methods：The linear range test and recovery test were used on high performance liquid chromatography （HPLC） analysis method for the rigor of the fingerprint. Two manufacturers provided 6 different batches of Mahuang Decoction， with a total of 12 batches， and with ephedrine hydrochloride， cinnamaldehyde， bitter apricot kernel， licorice glycoside reference acid as control products. Quantitative determination of HPLC content in the 4 components of each batch in Mahuang Decoction was calculated； at the same time， fingerprint HPLC was used to evaluate the quality of Mahuang Decoction. Results：1） In Mahuang Decoction， the effective ingredients including ephedrine， cinnamaldehyde， amygdalin and glycyrrhizic acid had good linear relationship within the scope of concentration was good， and the average recovery rate of 4 components were 100%， 1001%， 9939%， 9904%， with RSD of 17%， 13%， 11%， 099%. 2） The quality fluctuation of Mahuang Decoction samples from D manufactures was larger and the similarity was lower， while the quality fluctuation was lower， with high similarity and good consistency in B manufacture. Conclusion：The main components of Mahuang Decoction are ephedrine hydrochloride， cinnamic aldehyde， amygdalin and glycyrrhizic acid. The quality of Mahuang Decoction of B manufacture was better than that of D manufacture.

Key WordsFingerprint； Quantitative analysis； Mahuang Decoction； Quality evaluation

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.05.052

麻黃湯出自醫圣張仲景《傷寒論》，由麻黃、桂枝、杏仁、甘草4味藥組合而成，主治外感風寒表實證，癥見惡寒發熱，頭痛身疼，無汗而喘?，F代藥理學實驗研究顯示，麻黃湯具有抗流行性感冒、急性支氣管炎、支氣管哮喘的功效，具有明顯消炎抗菌作用[16]。國內外諸多醫家經過長期臨床實踐發現，療效確切。該藥方化學成分較為復雜，指紋圖譜技術可從整體上綜合分析湯方的化學物質內涵，是目前國際公認的控制中藥質量的質控標準模式[710]，我們利用高效液相色譜法（HPLC）技術全面分析麻黃湯的化學物質信息，以期為中藥湯劑使用提供客觀依據，現報道如下。

1儀器與試藥

11儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀；精密電子秤（蘇州奇樂電子科技有限公司，型號：FA2004C）。

12試劑購于中國食品藥品生物制品鑒定院的桂皮醛對照品（批號：111595200604）、苦杏仁苷對照品（批號：110777200406）、甘草酸對照品（批號：11075220012）、鹽酸麻黃堿對照品（批號：1107382000501）。

13分析樣品麻黃湯采用《傷寒論》中配伍比例3∶2∶2∶1，麻黃藥用部位為麻黃科植物草麻黃的干燥草質莖，桂枝藥用部分為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，杏仁藥用部分為薔薇科植物山杏的干燥成熟種子，甘草藥用部分為豆科植物甘草的干燥根和根莖。

2方法與結果

21色譜條件精密量取20 μL的樣品進樣量或對照品溶液，采用250 mm×46 mm，4 μm的色譜柱（Agilent ZORBAX XDBC18柱），在乙腈和01%磷酸的流動相中，流速為1 mL/min，柱溫為25 ℃，根據高效液相色譜（HPLC）（Agilent 1100型高效液相色譜儀）多指標成分定量測定色譜條件和指紋圖譜的梯度洗脫程序進行試驗。見表1、表2。

23供試品溶液制備麻黃藥用部位為麻黃科植物草麻黃的干燥草質莖，桂枝藥用部分為樟科植物肉桂的干燥嫩枝，杏仁藥用部分為薔薇科植物山杏的干燥成熟種子，甘草藥用部分為豆科植物甘草的干燥根和根莖，麻黃湯采用《傷寒論》中配伍比例3∶2∶2∶1，采用回流法煎煮，于敞口藥盆中稱取9 g麻黃，加400 mL水，浸泡30 min，煮沸后文火45 min，去沫減200 mL再加入6 g桂枝和杏仁、3 g甘草取煮沸文火20 min，取100 mL藥液，在60 ℃下減壓濃縮，定容至50 mL，折合麻黃湯濃度未04 g/ mL。取5 mL柴胡黃芩濃縮液用100%甲醇定容10 mL，混合均勻，取2 mL離心取上清液在045 μm超微膜濾過即可。

24專屬性試驗取同一供試品溶液根據23制備的供試品溶液，采用薄層層析的方法對麻黃湯進行專屬性試驗，結果顯示專屬性良好。

25線性關系考察根據11制備的對照品溶液，精密取01 μL、05 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，分別編號17并連續進樣，以峰面積為Y軸，5 μL進樣濃度為X軸，繪制標準曲線，并根據對照品的回歸方程計算各有效成分在各自濃度范圍內的線性關系。

26中間精密度試驗精密吸取10 μL同一供試品溶液，連續進樣5次，結果顯示相對標注偏差RSD是092%，精度度良好。

27供試品溶液穩定性試驗精密吸取10 μL同一供試品溶液，配置后分別放置0、2、4、8、16、24、48 h后進樣檢測，結果顯示48 h內供試品溶液基本穩定，RSD是095%。

28重復性試驗精密吸取10 μL同一供試品溶液，在相同色譜條件，相同液相分析儀上檢測5次，結果顯示標準偏差RSD為089%，重復性良好。

29加樣回收率試驗取6份同一供試品溶液根據11制備的供試品溶液，編號AF并分別加入鹽酸麻黃堿對照品、桂皮醛對照品、苦杏仁苷對照品、甘草酸對照品，計算各有效成分在HPLC中的加樣回收率。

麻黃湯中的有效成分鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸在各自濃度范圍內的線性關系良好，且這4中成分的平均回收率分別是1000%、1001%、9939%、9904%，RSD分別是17%、13%、11%、099%。見表3、表4。

210樣品測定結果

2101多指標成分定量東莞仁濟大藥房（簡稱D廠）提供6個不同批次麻黃湯藥材，根據11制備供試品溶液，分別編號S1、S2……S6中國北京同仁堂（集團）有限責任公司（簡稱B廠）提供6個不同批次麻黃湯藥材，根據11制備供試品溶液，分別編號S7、S8……S12，根據12中表1的色譜條件，以鹽酸麻黃堿對照品、桂皮醛對照品、苦杏仁苷對照品、甘草酸對照品，分別計算各批次麻黃湯中這4種成分的含量。

12批麻黃湯HPLC多指標成分定量分析各批次麻黃湯中的主要成分是鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸和其定量分析結果。見圖1、表5。

2102指紋圖譜同上12個批次麻黃湯藥材，制備成供試品溶液后精密吸取5 μL，根據12中表2的色譜條件依次測定并記錄12批麻黃湯的色譜圖。

根據《中藥指紋圖譜相似度評價系統2004A》中相似度的評價方法，選用夾角余弦法，由圖2、3顯示D廠中的麻黃湯藥材樣品質量波動較大，相似度較低，而B廠中麻黃湯藥材質量波動較小，相似度較高，一致性較好。

3討論

本研究利用梯度洗脫方法對麻黃湯中標志性指標鹽酸麻黃堿、桂皮醛、苦杏仁苷、甘草酸進行含量測定，并對12批次的麻黃湯藥材進行含量測定。在流動相選擇時本團隊曾經嘗試使用流動相相同梯度方法進行洗脫，結果存在部分峰拖尾嚴重的現象，而曾經我們亦嘗試使用乙腈與01%甲酸、乙腈與01%乙酸為流動相用相同梯度進行洗脫，結果發現基線無法實現平穩，我們認為產生這一結果的原因可能與甲酸、乙酸在270 nm出出現吸收現象有關。最終研究中我們將乙腈及01%磷酸最終設定為流動相的成分，結果顯示此流動相設置下所得的圖譜基線具有明顯平穩性，且波峰結果理想，分離效果理想，保留時間適中。

圖312批不同批次的麻黃湯指紋圖譜的相似度結果

在所選擇的色譜柱條件下我們發現各成分分離度高，色譜峰尖銳，分離時間亦理想，實驗結果充分可靠。該研究采用各地的不同批次進行指紋圖譜檢查分析，結果顯示不同批次的圖譜結果基本一致，在相似度檢測中各批藥材的相似度尚可，這說明經過國家藥物質量監督部分的努力，現中藥藥材市場上的藥材質量較前明顯改善。我們采用最大吸收波長作為不同有效成分的檢測指標，此類方法不但減少了實驗誤差，且可提高檢測靈敏度。

本研究我們將2個廠家的12批次藥材的指紋圖譜利用MATLAB軟件進行主要成分統計，結果發現D廠中的麻黃湯藥材樣品質量波動較大，相似度較低，而B廠中麻黃湯藥材質量波動較小，相似度較高，一致性較好。說明不同廠家藥材化學成分存在一定差異，我們認為不同廠家所選藥材可能因產地、種屬等差異，此外生產工藝亦存在一定差異，所以導致藥材產品質量訊在一定差異。在成分測定中我們看出麻黃堿吸收最大波長在250 nm，桂皮醛吸收最大波長為290 nm，苦杏仁苷及甘草酸分別為270 mm及278 nm，因為苦杏仁苷及甘草酸出峰的間隔時間較短，來不及變換明顯波長，而在250 nm波長麻黃堿有較強的吸收，在290mm桂皮醛有明顯吸收，這一結果與國內外諸多文獻[1116]數據一致。因此，對于檢測組方中不同成分盡量采用其最大吸收波長作為檢測波長，即可提高檢測靈敏度，又可減少誤差。

HPLC完整體現了麻黃湯的組方特征，同時驗證了該藥對產生最大藥物效價，以期指導臨床運用。

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