黃芪桂枝五物湯對老年糖尿病腎病轉化生長因子-β基因表達調控區甲基化的影響

李國宏 紀品川 王雅君

摘要 目的：觀察黃芪桂枝五物湯對老年糖尿病腎病（DN）的臨床療效，同時分析其對轉化生長因子-β（TGF-β）基因表達調控區甲基化的影響。方法：選取2016年6月至2017年6月承德市中醫院收治的老年DN患者90例，隨機分成對照組和觀察組，每組45例。2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，觀察組在此基礎上加用黃芪桂枝五物湯，2組均以6周作為1個療程，3個療程后觀察療效、蛋白尿排泄率和TGF-β基因甲基化水平。結果：2組臨床總有效率比較，觀察組優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。治療后2組患者UAER均較治療前改善，觀察組改善的幅度更為明顯（P<0.05）。治療后2組的VEGF蛋白和mRNA表達均有所下降，其中觀察組下降的趨勢較對照組明顯（P<0.05）。觀察組TGF-β基因甲基化為（13.66±8.22）%，對照組組為（66.89±11.18）%，明顯低于觀察組（P<0.05）。結論：黃芪桂枝五物湯可有效治療老年糖尿病腎病，其作用機制可能與降低TGF-β基因表達調控區甲基化水平有關。

關鍵詞 黃芪桂枝五物湯;2型糖尿病;糖尿病腎病;老年;臨床療效;轉化生長因子-β基因;甲基化;作用機制

Effects of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on Methylation of TGF-β Gene Expression Regulatory Region

in the Treatment of Elderly Patients with Diabetic Nephropathy

Li Guohong， Ji Jinchuan， Wang Yajun

（Chengde City Hospital of Geriatrics， Hebei 067000， China）

Abstract Objective：To observe the clinical effects of Huangqi Guizhiwuwu Decoction on senile diabetic nephropathy and to analyze its effects on methylation of TGF-β gene expression regulatory region. Methods：A total of 90 cases of elderly DN patients admitted to our department from June 2016 to June 2017 were randomly divided into control group and observation group， with 45 cases in each group. Two groups of patients were under instruction of diabetes education， and took diabetes diet. Patients in the observation group took Huangqi Guizhi Wuwu Decoction on the basis of therapeutic schedule， and all the patients were treated for 3 courses （6 weeks as a course of treatment）. After the treatment， clinical effects， proteinuria excretion rate and TGF-β gene methylation levels were observed. Results：1） The comparison of total effective rates of the two groups were statistically significant （P<0.05）， and the rate in the observation group was superior to that in the control group. 2） After treatment， the uAER of the two groups was improved compared with that before treatment， and the improvement of the observation group was more significant （P<0.05）. 3） The expressions of VEGF and mRNA in the two groups decreased after treatment， and the trend of the observation group was significantly lower than that of the control group （P<0.05）. 4） The level of methylation of TGF-β gene was （13.66±8.22）% in the observation group and （66.89±11.18）% in the control group， which was significantly lower than that in the observation group （P<0.05）. Conclusion：Huangqi Guizhi Wuwu decoction can effectively treat senile diabetic nephropathy and its mechanism may be related to reducing the level of methylation of TGF-β gene expression regulation.

Key Words Huangqi Guizhi Wuwu Decoction; Type 2 diabetes mellitus; Diabetic Nephropathy; Elderly; Clinical efficacy; TGF-β Gene; Methylation; Mechanism

中圖分類號：R289.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.024

糖尿病腎病（Diabetic Nephmpathy，DN）是由遺傳、代謝因素、腎臟系統血流動力學、各種細胞因子及氧化應激共同作用所導致的作為糖尿病的常見并發癥之一，其臨床表現常以持續性微量蛋白尿和腎小球濾過率進行性下降為主[1]。該病主要是以老年人為主，隨著目前生命質量的改善及人口老齡化，老年DN發病率逐年上升，在老年性疾病中高達46%[2]。老年DN是一個緩慢發展的過程，腎功能的早期損害是可逆的，而腎功能損害是糖尿病的并發癥，故如果能在糖尿病早期予以及時有效的治療，不僅可避免腎功能損害的發生，也可延緩老年DN的惡化。

目前，在中醫古籍中，并沒有對對老年DN有詳細描述，其認為多屬于“消渴”“水腫”“脹滿”“關格”等范疇，并認為其發病機制為：臟氣虛衰、瘀血阻滯、水濕內停[3]。近幾年多采用西藥來延緩腎衰竭，但發現各類西藥均能產生不良反應，從某種程度上加重腎衰竭，使患者難以耐受，對老年DN患者尤甚。故尋找療效好不良反應小的DN治療方案對老年患者而言尤為重要，中藥湯劑的治療價值逐漸引起重視。黃芪桂枝五物湯為溫陽利水經典方，近幾年臨床上諸多證據顯示其對DN有顯著的療效和安全性。本研究采用黃芪桂枝五物湯為主方，選取90例老年DN患者作為研究對象進行探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2017年6月收住我科的老年DN患者90例，男45例，女45例，年齡55～75歲，平均年齡（60.4±3.2）歲，平均住院時間8～15 d，平均住院時間（10±2.3）d，體重指數（22.4±5.21）kg/m2。并發癥：肥胖4例，高血壓12例，高脂血癥8例。將這90例患者隨機分成對照組和觀察組，各45例。觀察組男21例，女24例，平均年齡（61.2±2.2）歲，平均病程（16.9±7.22）年;對照組男21例，女24例，平均年齡（60.2±3.2）歲，平均病程（22.9±7.9）年，2組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具可比性。本研究方案經過醫院倫理學委員會審查批準。

1.2 診斷標準 1）中華醫學會2010年頒布的《中醫內科常見病診療指南》中DN診斷標準以及世界衛生組織（WHO）DN診斷標準;2）尿蛋白排泄率20～200 μg/min[4]。

1.3 納入標準 1）符合1.2診斷標準者;2）年齡55～75歲者;3）對中藥耐受者;4）入組患者及家屬均知情同意，并簽署知情同意書[5]。

1.4 排除標準 1）嚴重心、肝、腎臟功能異常者;2）近3個月內有使用抗血小板藥物或大動脈出血者;3）惡性腫瘤及嚴重感染者;4）接受本研究治療時接受其他相關治療者;5）妊娠期、哺乳期婦女;6）精神障礙或語言溝通不暢者;7）中藥不耐受者;8）不簽署知情同意書患者[5]。

1.5 脫落與剔除標準 1）在治療過程中因故中途退出者;2）隨訪中自然脫落者;3）治療過程出現明顯不良反應者;4）依從性差者[5]。

1.6 治療方法 2組患者均接受糖尿病教育、糖尿病飲食，口服降糖藥物或者皮下注射胰島素治療（降糖藥和胰島素劑量均根據患者病情及血糖水平而定）;合并高血壓者加用硝苯地平緩釋片（安徽永生堂藥業有限責任公司，國藥準字203H88030），10 mg，1次/d;合并高脂血癥者加服辛伐他汀（杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字J20090001），40 mg，1次/d。觀察組在上述治療方案基礎上加用黃芪桂枝五物湯，具體方劑如下：黃芪45 g，桂枝、雞血藤、花粉、白芍各20 g，紅花、牛膝、乳香、生姜各15 g，甘草8 g，大棗2枚）。頭暈嚴重者加天麻10 g;四肢冰冷明顯者加肉桂10 g;四肢麻痹明顯者加地龍10 g;嘔吐者加用半夏8 g、藿香8 g。1劑/d，3次/d，2組均以6周作為1個療程，3個療程后觀察療效。

1.7 觀察指標

1.7.1 蛋白尿排泄率 留取患者24 h尿液，加入Dimethylbenzene進行防腐，采用放射免疫法對尿蛋白Alb進行測定，然后根據尿液的容積和所得Alb數值計算出蛋白尿排泄率（UAER）。臨床總有效率界定方法如下：臨床痊愈：臨床癥狀完全消失，各指標基本恢復正常;有效：UAER下降超過1/2;腎功能正常;顯效：臨床癥狀較治療前好轉;UAER有所下降，但不足顯效標準，24 h尿蛋白定量較治療前下降不到l/2，腎功能指標正常;無效：臨床癥狀未改善或惡化;實驗室指標無變化或升高[6]。

1.7.2 mRNA水平檢測 取不同組別患者治療前及治10周后前臂外周抗凝血5 mL，加入適量淋巴細胞分離液。隨后取肝素抗凝靜脈血與等量Hank液充分混勻，使用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞，根據每107數量的細胞加入1 mL Trizol的比例進行裂解，震蕩30 s;加0.2 mL氯仿，12 000× g，4 ℃離心，15 min;輕輕吸取上層無色水相至0.5 mL EP管中;加等體積異丙醇后4 ℃離心，12 000×g，10 min;在管底部可見微量RNA沉淀。加入75%乙醇1 mL，棄上清，干燥后用DEPC水溶解RNA，根據所RNA濃度，計算RNA體積[6]。按照逆轉錄試劑盒以及相關引物說明書加入相應量的試劑進行聚合酶鏈反應，引物序列：F ATTGAGACCCTGGTGGAC，R CCTATGTGCTGGCTTTGG;β-actin引物序列：F TGACAGGATGCAGAAGGAGA，R GCTGGAAGGTGGACAGTGAG。取PCR產物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像。BIO-LAB圖像軟件分析電泳條帶[6]。

1.7.3 BSP檢測轉化生長因子-β（TGF-β）基因表達調控區甲基化水平 采用ABi軟件以TGF-β表達調控區CpG富含區域為靶向序列設計引物，擴增TGF-β基因指定段的序列，包括啟動子和第一個外顯子序列，其啟始位點為1，共440 bp。PCR反應體系50 μL，其中經修飾后的DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP共1 μL，DNA聚合酶1 μL，蒸餾水40 mL。常規PCR反應體系條件下擴增34個區域。擴增產物在電泳后取一定劑量送往蘇州生物工程股份有限公司測序[6]。

1.8 統計學方法 使用SPSS 23.0統計軟件對本研究數據進行分析，符合正態分布的計量資料用（±s）表示，并用t檢驗;不符合正態分布的資料予以秩和檢驗，計數資料組間比較用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組臨床療效比較 2組臨床總有效率比較，觀察組優于對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 2組臨床療效比較

注：與對照組比較，*P<0.05

2.2 2組UAER比較 經過治療后2組患者UAER均較治療前改善，其中觀察組改善更為明顯（P<0.05）。見表2。

表2 2組UAER比較（±s）

注：與本組治療前比較，*P<0.05，與對照組治療后比較，△P<0.05

2.3 2組VEGF蛋白和mRNA的表達變化 經過治療后2組的VEGF蛋白和mRNA表達均有所下降，其中觀察組下降的趨勢較對照組明顯（P<0.05）。見圖1。

2.4 B TGF-β基因表達調控區甲基化比較 觀察組甲基化為（13.66±8.22）%;對照組組為（66.89±11.18）%，明顯低于觀察組（P<0.05）。

圖1 2組VEGF mRNA比較

3 討論

糖尿病腎病（DN）屬于糖尿病（DM）終末期的繼發性腎損傷，早期的DM腎體積較大，GFR升高，隨著病情的加重，病程的延長，繼發性進行性腎損傷的發生，使腎小球間隙慢慢出現微量蛋白尿，之后繼而出現持續蛋白尿、水腫、高血壓、腎臟縮小，進而發展為腎衰終末期、尿毒癥，生存率僅有25%[7]。隨著人口老齡化，近年來，老年人DN發病率逐年上升，對老年人而言，DM繼發腎損傷的進展尤為迅速。有研究證實，糖尿病的腎損傷在早期具有可逆性，因此，對于老年人DN而言，盡早治療糖尿病腎損傷，對于延緩其惡化尤為重要。

中醫學認為，DN多由先天稟賦不足、脾腎虛損、氣血雙虧、瘀血阻滯所致。故對于老年DN的治療，應主要以活血化瘀、滋陰生氣、補腎健脾等為主[8]。黃芪桂枝五物湯在中藥中主要為醫治痹癥之方，對活血化瘀、滋陰生氣、補腎健脾大有裨益，可延緩腎損傷。黃芪以甘溫益氣通陽為主，屬于黃芪桂枝五物湯的君藥;桂枝則通經活絡通痹;雞血藤舒經解郁，止痛活絡;赤芍、紅花活血化瘀瘀，益氣利血;生姜、大棗滋陰生氣、補腎健脾[8]。在本研究中，也證實了該方對DN的療效，不僅緩解癥狀，且改善各臨床指標。

研究表明，轉化生長因子-β（TGF-β）基因作為一種重要的抑癌基因，既能抑制癌細胞形成，又能推動癌細胞激進生長[9]。激活TGF-β基因的表達對誘導DM患者系膜細胞轉分化信號有至關重要的作用[10]。本研究顯示，DN患者血清TGF-β基因甲基化水平明顯低于對照組，進一步證明了TGF-β基因參與了DN的發病。VEGF在血漿表達較低，作為小分子蛋白質其生理作用則是，通過表達的激活，維持血管完好無破損，它之所以發揮生物學作用，靠的是其與血管內皮細胞上的酪氨酸激酶受體結合而產生作用[11-12]。然而，其在病理狀態時，因為組織的缺氧，改變微血管的微環境，VEGF表達過度增強，使管壁通透性增加，尿蛋白外溢，進而損害腎功能[13]。故本研究選取其為觀測腎損害嚴重程度的指標之一。無論在動物實驗還是臨床研究，均已證實，VEGF在損傷的腎臟組織中高表達[14-15]。因此，若使DN患者的VEGF的表達水平降低，是否就可以延緩腎損傷。本研究2組患者均接受常規的治療，觀察組加用黃芪桂枝五物湯，發現治療后老年患者的的UAER有所改善，且患者血漿中VEGF表達降低，因此，推測患者腎功能改善的可能是通過下調VEGF表達來實現。

我們還對2組患者治療前后的UAER與VEGF進行分析，發現DN的進展與兩者有密切關聯，因此，UAER與VEGF聯合對評估DN的疾病嚴重程度是確實可行的。

綜上所述，DN的發生與TGF-β基因的甲基化水平具有密切關系，而黃芪桂枝五物湯可以通過降低其甲基化水平逆轉DN腎損傷。但由于本研究樣本量相對小，且隨訪時間不足，在后續進一步的研究中盡可能采用大樣本量并增加隨訪時間，進一步證實黃芪桂枝五物湯與老年DN患者TGF-β基因的甲基化水平的明確關系及其機制，以指導臨床用藥。

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