隔藥餅灸對子宮內膜異位癥大鼠過氧化物酶增殖體激活受體-γ和細胞間黏附分子-1表達的影響

周志剛 王曉潔 肖小文 王萍 覃肯

摘要 目的：觀察隔藥餅灸對子宮內膜異位癥大鼠過氧化物酶增殖體激活受體-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR-γ）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）表達的影響。方法：選取34只大鼠，將其隨機分為空白對照組（8只）和造模組（26只），采用改良的造模法建立子宮內膜異位癥大鼠模型。將造模成功的24只大鼠隨機分為模型組、隔藥餅灸組和丹那唑組，每組8只。采用Western blot檢測各組樣本ICAM-1和PPAR-γ的表達。結果：與空白對照組比較，模型組、隔藥餅灸組和丹那唑組大鼠的ICAM-1的表達顯著上升（均P<0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組和丹那唑組的ICAM-1的表達顯著降低（均P<0.05）;與空白對照組比較，模型組、隔藥餅灸組和丹那唑組PPAR-γ的表達顯著降低（均P<0.05），與模型組比較，隔藥餅灸組和丹那唑組的PPAR-γ的表達顯著增強（均P<0.05）。結論：隔藥餅灸能抑制ICAM-1表達，促進PPAR-γ的表達，從而抑制子宮內膜細胞的黏附，阻止血管生成。

關鍵詞 子宮內膜異位癥;隔藥餅灸;細胞間黏附分子-1;過氧化物酶增殖體激活受體-γ;關元

Effects of Herb-partitioned Moxibustion on the Expression of ICAM-1 and PPARγ in Rats with Endometriosis

Zhou Zhigang1， Wang Xiaojie2， Xiao Xiaowen2， Wang Ping2， Qin Ken3

（1 Graduate College of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China; 2 School of Fundamental

Medicine of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China; 3 Medical Department

of Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China）

Abstract Objective：To observe the effects of herb-partitioned moxibustion on the expression of ICAM-1 and PPARγ in rats with endometriosis. Methods：A total of 34 female rats were randomly divided into 8 rats as control group and 24 rats for model establishment group. The endometriosis model was established by modified methods. 24 model rats were randomly divided into the model group， the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group with 8 rats in each group. The expression of ICAM-1 and PPARγby was detected by western blotting method. Results：Compared with the control group， the expression of ICAM-1 in the model group， the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group was significantly increased （P<0.05）; compared with the model group， the expression of ICAM-1 in the herb-partitioned moxibustion group and danazol group was significantly decreased （P<0.05）; compared with the control group， the expression of PPARγ in the model group， herb-partitioned moxibustion group and Danazol group was significantly decreased （P<0.05）. Compared with the model group， the expression of PPARγ in the herb-partitioned moxibustion group and the Danazol group was significantly increased （P<0.05）. Conclusion：Herb-partitioned moxibustion can inhibit the expression of ICAM-1 and boost the expression of PPARγ， which can inhibit the adhesion of endometrial cells and prevent angiogenesis.

Key Words Endometriosis ; Herb-partitioned moxibustion; ICAM-1; PPARγ ; Guanyuan （RN 4）

中圖分類號：R245;R711.3文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.038

子宮內膜異位癥（Endometriosis，EMs）是指子宮內膜組織出現在子宮以外，臨床常表現出痛經、性交痛，不孕等癥狀。其發病機制和原因尚不明確，但大多數學者認為其病理生理過程包括異位病灶的黏附、侵襲和血管形成[1]。嚴重影響到女性的正常生活[2]。研究顯示，EMs在育齡女性中的流行率達15%，而50%的不育患者合并EMs，50%～60%各種盆腔疼痛的女性也合并有EMs[3]。臨床治療以手術和藥物治療為主，藥物治療存在著許多不良反應，而手術治療切除病灶但仍可復發且增加組織黏連風險而導致卵巢功能受損甚至喪失[4]。灸法治療EMs能有效地改善患者臨床癥狀、防止復發、降低某些藥物不良反應、促進妊娠，且其價格相對低廉，無明顯毒性反應，作用時間持久[5]，適于長期使用等獨特的優勢[6]。這有利于降低生產力損失、生命損害和醫療保健的消費，從而降低患者和社會的醫療成本。但灸法治療子宮內膜異位癥的機制還有待于進一步闡明，本研究通過檢測異位子宮內膜過氧化物酶增殖體激活受體-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR-γ）和細胞間黏附分子-1（Inter-cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）的表達來闡明隔藥餅灸對異位子宮內膜的黏附和新生血管形成的影響?，F報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[動物許可證號SCXK（湘）2013-0004]的清潔級健康雌性未孕9周SD大鼠，體重（200±20）g。所有實驗大鼠置于室溫（25±2）℃環境下飼養，自由飲水和攝食。

1.1.2 藥物

藥餅[上海市針灸經絡研究所制備（將木香、紅花、肉桂、丹參、附子等切碎研磨，以黃酒調和）];達那唑膠囊（民生藥業，國藥準字H33022461）;直徑5 mm細艾條（南陽漢醫艾絨有限責任公司）;

1.1.3 試劑與儀器

磷酸酶抑制劑（碧云天生物技術研究所）、PMSF（碧云天生物科技研究所）、RIPA裂解液（碧云天生物科技研究所）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天生物科技研究所）、蛋白maker（北京全氏金生物技術有限公司）、PVDF膜（Millipore）、β-actin抗體（武漢博士德生物工程有限公司）、檢測抗體PPAR-γ和ICAM-1（武漢三鷹生物技術有限公司）、顯影定影試劑盒（武漢巴菲爾生物技術有限公司）。微量移液器（Eppendorf），電泳儀電源（北京六一儀器廠，型號DYY-7C），垂直電泳槽（北京六一儀器廠，型號DYCZ-24DN），電轉儀（北京六一儀器廠，型號DYCZ-40），水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號TS-1），PH計（德國Metter-Toledo GmbH公司，型號LP115），CPA型號電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

將34只清潔級雌性大鼠隨機分為空白對照組（8只）和造模組（26只）。造模組給予5 d乙烯雌酚0.02 mg/kg灌胃，使大鼠處于動情期。參照自體移植造模方法進行造模[7]，造模7 d后隨機挑選2只造模組大鼠給予斷頭處死并解剖顯示病灶部位有5～8 mm的半透明囊腫，囊腫內充滿液體并有血管形成，提示造模成功。

1.2.2 給藥方法

將24只造模成功的大鼠分為模型組、隔藥餅灸組和丹那唑組，每組8只。1）空白對照組：將大鼠放入自制固定器中，使其頭部、四肢、尾部固定，暴露關元穴，固定器置于支架上，不做其他處理，7 d為1個療程，共2個療程，療程間隔3 d。2）模型組：將大鼠放入自制固定器中，使其頭部、四肢、尾部固定，暴露關元穴，固定器置于支架上，不做其他處理，7 d為1個療程，共2個療程，療程間隔3 d。3）隔藥餅灸組：大鼠固定后，在關元穴處涂醫用凡士林少許，放置藥餅（直徑約0.5 cm），制小艾炷（綠豆大小，重量約15 mg），直接放在藥餅上，用線香點燃，待艾炷燃至大鼠掙扎時用鑷子夾去，每穴灸2壯，持續時間約10 min，7 d為1個療程，共2個療程，2個療程中間隔3 d;4）丹那唑組：給予灌胃丹那唑混懸液（每天以36 mg/kg體重給藥），1次/d，7 d為1個療程，共2個療程，2個療程間隔3 d。

1.2.3 檢測指標與方法

ICAM-1和PPAR-γ表達：用Western blot檢測。取適量RIPA裂解液勻漿組織，根據蛋白分子量配制10%PAGE膠電泳，待測定蛋白濃度后，各樣品取50 μg總蛋白上樣電泳，判斷目的蛋白得到充分分離（根據預染marker顯示），取出marker切下的目的條帶，用蒸餾水沖洗，將電轉液中浸泡的與PAGE凝膠相同大小的PVDF膜取后浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）中室溫搖床封閉2 h。將PVDF膜浸泡在用封閉液稀釋的相應一抗孵育液（1∶2 000稀釋）4 ℃中過夜，用TBST充分洗滌PVDF膜后將PVDF膜浸泡于封閉液稀釋相應的標記二抗孵育液（1∶50 000稀釋），室溫搖床孵育2 h。之后顯色曝光。用BandScan分析膠片灰度值，用β-actin作為內參，計算出ICAM-1/β-actin和PPAR-γ/β-actin的值進行分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，各組間數據采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ICAM-1檢測結果 與空白對照組比較，模型組、隔藥餅灸組、丹那唑組3組ICAM-1的表達量顯著升高（均P<0.05）;與模型組組比較，隔藥餅灸組、丹那唑組組中ICAM-1的表達量顯著下降（均P<0.05）;與隔藥餅灸組比較，丹那唑組的ICAM-1表達下降，差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 PPAR-γ檢測結果 與空白對照組組比較，模型組、隔藥餅灸組和丹那唑組PPAR-γ的表達量顯著降低（均P<0.05）;與模型組組比較，隔藥餅灸組、丹那唑組中PPAR-γ的表達量顯著增強（均P<0.05）;與隔藥餅灸組比較，丹那唑組的PPAR-γ表達量降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 4組ICAM-1/β-actin及PPAR-γ/β-actin的表達（±s）

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與模型組比較，△P<0.05

3 討論

子宮內膜異位癥雖是良性疾病，但其病理特征具有惡性腫瘤的特性[8]。研究發現，子宮內膜在盆腹腔突破腹膜及器官“防線”，在“異域”生根、生長以至發病，要經過黏附（Attachment）、侵襲（Aggression）和血管形成（Angiogensis）等3個分子與病理變化過程，稱之為“3A”模式[9];而內異癥患者在位內膜的“3A”能力明顯增強，其內膜逆流進入腹腔后，它們必須先和腹膜發生黏附，同時子宮內膜細胞之間也需要黏附、積聚成團，并且能突破機體的防御體系，才可能成功地種植生長[1]，導致疾病的發生。

實驗研究表明，子宮內膜的異位生長需要細胞的黏附，在這個過程中細胞間黏附分子（Inter-cellular Adhesion Molecule-1，ICAM-1）發揮關鍵作用[10]。ICAM-1是單鏈糖蛋白的一種，為淋巴細胞功能相關抗原-1的配體，屬于細胞黏附分子中的免疫球蛋白超級家族一員。研究發現，ICAM-1可介導細胞與細胞之間的黏附[11]，參與細胞信號轉導、炎性反應等生理和病例過程[12]。有研究發現EMs異位內膜ICAM-1存在高表達，與疾病有密切的關系[13]。

過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（Peroxisome Proliferator-activated Receptor-γ，PPAR）屬于Ⅱ型核受體超家族成員之一，PPAR-γ參與了機體多種生理病理過程，包括脂肪代謝、糖代謝、細胞增殖與分化、腫瘤發生、炎性反應及免疫反應等[14]。PPAR-γ通過與配體結合被激活產生炎性反應抑制反應、阻止血管生成等作用，這引起了廣大科研學者的廣泛關注，可能成為治療子宮內膜異位癥的新靶點。PPAR-γ在異位子宮內膜組織中表達情況的研究報道較少。Ohama等[15]研究表明PPAR-γ在體外培養的子宮內膜異位內膜基質細胞中有表達，而McKinnon等[16]發現PPAR-γ蛋白在人異位子宮內膜基質細胞和上皮細胞均呈高表達。Nenicu等[17]研究發現替米沙坦抑制小鼠異位子宮內膜異位組織生長除了通過阻斷血管緊張素Ⅱ受體途徑外，還與激活PPAR-γ途徑有關。研究發現，PPAR-γ激動劑羅格列酮顯著抑制狒狒腹膜異位子宮內膜組織的生長[18]，而且能顯著抑制小鼠子宮內膜異位損傷部位體積[19]。由此推斷PPAR-γ異位子宮內膜是非低表達，由上可知兩者似有矛盾之處。

研究發現，灸法能抑制細胞ICAM-1的表達從而抑制細胞的黏附過程[20]，灸法可以激活細胞PPAR-γ的表達，有類似PPAR-γ激動劑作用[21]。我們前期研究發現，現代文獻針灸治療子宮內膜異位癥主要取穴為關元、三陰交、氣海、中極、子宮，經脈以任脈、足太陰脾經為主，主要分布在胸腹部，特定穴以募穴為主[22]，與中藥組、西藥組比，針灸治療EMs的有效率及改善癥狀的療效更佳，在VAS疼痛評分方面，針灸組相比對照組的治療效果更具有優勢[23]。在此研究基礎上我們在關元穴上施隔藥餅灸探討其對子宮內膜異位癥大鼠信號轉導通路的影響，結果顯示隔藥餅灸可以調控p38MAPK信號通路，減少IL-4表達，促進IFN-表達，介導炎性反應，促進Th細胞向Th1分化，Th細胞動態平衡有恢復趨勢。

子宮內膜異位癥是西醫學病名，在中醫學中并無此病名，根據其臨床癥狀屬于月經不調、不孕、崩漏等范疇。灸法不僅能提高患者妊娠率，緩解癥狀，而且無不良反應且降低醫療成本[5]。關元穴為下腹部靠近胞宮的任脈穴位，具有行氣止痛、活血化瘀的功效。有研究顯示EMs的病機是瘀阻沖任，在EMs的針灸取穴均以任脈穴位作為主穴，通過調理沖任使機體氣血陰陽平衡，而關元穴的頻次最高[22]。調查表明任脈穴位的常用功效有健脾和胃、調腹、調經引產、壯腎利尿等17項，這些功能可歸納為兩大類：一是治療任脈循行部位的疾病;二是治氣、補虛、散寒、清熱。“調腹（散積）”的功效出現702次。附子餅由木香、紅花、肉桂、丹參、附子等組成，具有疏肝理氣、活血化瘀的功效[24]，研究顯示活血化瘀中藥能抑制異位子宮內膜的生長[25]，對子宮內膜異位癥的治療有顯著療效[26]。

本研究在前期研究結果基礎上，探索隔藥餅灸對EMs“3A”模式中黏附和血管形成病理過程中作用。本研究結果發現，模型組大鼠的ICAM-1表達顯著上升，推斷在子宮內膜癥病理過程中，ICAM-1高表達，介導異位內膜細胞與細胞之間的黏附，參與細胞信號轉導、炎性反應等生理和病理過程;經隔藥餅灸處理后，異位內膜組織中的ICAM-1的表達下調，可以推斷在關元穴實施隔藥餅灸后，經過艾灸的生物和非生物效應激，可以抑制ICAM-1的表達，使病理過程向良好方向發展。目前國內尚無子宮內膜異位癥PPAR-γ表達的報道，但有報道發現子宮內膜癌患者的子宮內膜PPAR-γ呈低表達，在高分化的腫瘤細胞中呈高表達[27]。本實驗顯示，與空白對照組比較，模型組大鼠子宮內膜PPAR-γ明顯降低，經過隔藥餅灸和丹那唑治療后，子宮內膜PPAR-γ表達明顯增強。本實驗結果與McKinnon等[16]報道子宮內膜PPAR-γ高表達相反，但根據Nenicu等[17]抑制小鼠異位子宮內膜異位組織生長與激活PPAR-γ有關的報道，可以推斷子宮內膜PPAR-γ表達至少是非低表達，因此本實驗數據更符合實際。所以我們可以推測在關元穴實施隔藥餅灸具有類似PPAR-γ激動劑作用，可以阻止新生血管形成。

由此可知，隔藥餅灸可以抑制子宮內膜異位癥大鼠ICAM-1和促進PPAR-γ的表達來抑制細胞與細胞之間的黏附作用和阻止新生血管形成。這為臨床使用隔藥餅灸治療EMs提供了有力的理論指導。

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